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摘要足细胞损伤是肾脏疾病发生发展的中心环节，足细胞是肾小球脏层上皮细胞，附于肾小球基底膜表面，是肾小球滤过屏障的重要组成，它功能多样、结构复杂，是一种终末分化细胞。足细胞在维护肾小球滤过屏障完整性、蛋白尿形成和肾小球硬化中具有重要作用。有研究表明，感染、免疫、代谢及环境毒素均能导致足细胞损伤，引发肾脏疾病。<br>　　microRNA(miRNA)是一类小的（～21个核苷酸）非编码RAN，可以在转录后水平抑制或者降解目标RNA。近年来， miRNA在足细胞损伤中的作用备受关注。足细胞特异性Dicer酶敲除小鼠模型表现为显著的足细胞损伤、蛋白尿和肾小球硬化。通过系统生物学分析，我们推测Dicer酶敲除小鼠肾脏表型可能与足细胞miRNA-30家族(miR-30s)丢失密切相关。以此为切入点，我们深入研究miR-30s参与足细胞保护的机制，并有望从一个全新的角度诠释足细胞损伤保护新机制。<br>　　研究一:miR-30s与足细胞损伤研究<br>　　目的:分析体内外足细胞在损伤因子刺激后miR-30s表达的改变，探索miR-30s表达下降是否参与了足细胞损伤。<br>　　方法:收取临床及病理诊断明确的FSGS患者肾组织标本，以肾脏透明细胞癌患者癌旁正常肾组织为对照，显微镜下微分离肾小球行RT-PCR明确miR-30s在FSGS患者肾小球中的表达。采用原位杂交方法检测miR-30s在正常人及 FSGS患者肾小球中的分布。利用慢病毒转染构建miR-30a高表达的人足细胞系。通过TGF-β/LPS/PAN刺激实验组和对照组细胞，采用tunel法、Annexin v法观察miR-30s在足细胞中的抗凋亡作用。通过F-actin染色验证miR-30s对足细胞骨架的保护作用。采用RT-PCR检测Notch1、Jagged1、Hes1、Hey1、Trp53、Cdknla、Bax、Apaf1等蛋白的mRNA水平，采用western blotting检测及免疫组化检测ICN1、Notch1、Caspase3、P53蛋白的表达。构建PAN大鼠足细胞损伤模型，通过体内实验观察miR-30s对足细胞的保护作用。<br>　　结果:我们研究发现，miR-30s在肾小球中特异性的表达于足细胞，原位杂交及荧光定量PCR结果提示FSGS患者肾小球中miR-30s成员表达显著下降。体外试验进一步发现一些常见的足细胞损伤因素如TGF-β/LPS/PAN均可下调足细胞miR-30s表达。经miR-30a质粒转染的足细胞可以有效抵御刺激因子所引起的足细胞损伤，如足细胞骨架紊乱/消失、足细胞凋亡等。相反，我们通过转染miRNA30-“sponge”质粒敲除足细胞miR-30s后，可以观察到明显的足细胞损伤，同时，它们对损伤因素刺激也更加敏感。这些实验说明miR-30s在足细胞中起着明显的保护作用，同时我们还发现，糖皮质激素可以维持足细胞miR-30s水平，抑制TGF-β等诱导的足细胞损伤。此外，我们进一步研究发现，Notch1在足细胞中为miR-30s的靶基因。miR-30s可以抑制Notch1受体表达阻断Notch1信号通路活化从而抑制足细胞凋亡。体外试验证实，足细胞经过TGFβ刺激后，Notch1信号通路显著激活，而转染miR-30a质粒的足细胞在TGFβ刺激后Notch1信号通路活化得到明显的抑制。最后，我们体内实验发现嘌呤霉素(PAN)大鼠肾小球足细胞中miR-30s表达显著下降，糖皮质激素治疗后，大鼠肾小球中足细胞miR-30s部分恢复，并且可以显著减缓PAN大鼠肾脏损伤。<br>　　结论:miR-30s在肾小球中特异性表达于足细胞且含量丰富，在损伤因素刺激下，足细胞中miR-30s表达下降，通过活化Notch1通路介导足细胞损伤。糖皮质激素可以维持miR-30s表达从而起到足细胞保护作用。<br>　　研究二:miRNA-30家族调控足细胞Calcium-Calcineurin信号通路<br>　　目的:Calcium-calcineurin信号异常激活可以导致足细胞损伤，但是其机制目前仍未十分明确。calcium-calcineurin通路中的多种相关分子都被预测为miR-30s的靶基因。miR-30s在足细胞中表达下降可以导致足细胞骨架损伤的发生，但其具体的机制不明确。本研究的目的是探索miR-30s是否可以抑制足细胞calcium-calcineurin信号通路从而起到足细胞保护的作用。<br>　　方法:本研究通过构建足细胞特异性miR-30 Sponge转基因小鼠，嘌呤霉素核苷酸(PAN)大鼠进行体内实验，利用小鼠永生足细胞系进行体外试验，利用FSGS患者肾组织进行免疫组化等试验。<br>　　结果:我们研究发现calcium-calcineurin信号通路相关分子TRPC6、PPP3CA、PPP3CB、PPP3R1及NFATC3在足细胞中含有高丰度的mRNA水平，但是其蛋白水平极低。TRPC6、PPP3CA、PPP3CB、PPP3R1及NFATC3蛋白在FSGS患者足细胞中表达显著上升，但mRNA含量保持不变。通过荧光素酶报告试验，我们进一步发现这些基因都是miR-30s的靶基因。体外试验证实，miR-30s可以抑制足细胞TRPC6、PPP3CA、PPP3CB、PPP3R1及NFATC3蛋白表达，同时可以抑制足细胞钙内流、calcineurin活性以及NFATC3的核转移。体内实验我们发现，与对照小鼠相比，足细胞特异性miR-30 Sponge转基因小鼠可自发出现蛋白尿，足突融合，同时，TRPC6、PPP3CA、PPP3CB、PPP3R1及NFATC3蛋白表达显著上调。此外，我们还发现PAN大鼠模型足细胞TRPC6、PPP3CA、PPP3CB、PPP3R1及NFATC3蛋白表达上升，而糖皮质激素腹腔注射或者miR-30a质粒尾静脉注射可以减少上述蛋白的表达并减轻PAN大鼠肾脏损伤的症状。<br>　　结论: miR-30s通过抑制TRPC6、PPP3CA、PPP3CB、PPP3R1及NFATC3蛋白表达紧密控制足细胞calcium-calcineurin信号通路活性。足细胞miR-30s表达下调将导致calcium-calcineurin信号通路异常活化并诱导足细胞损伤。