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摘要奥硝唑[1-（3-氯-2-羟丙基）-2-甲基-5-硝基咪唑]为继甲硝唑、替硝唑之后的第三代硝基咪唑类抗菌药，具有良好的抗原虫和抗厌氧菌感染的作用，临床上广泛应用于预防与治疗阿米巴原虫病、贾第鞭毛虫病、阴道毛滴虫病、克罗恩病以及各种厌氧菌引起的感染。本课题系统研究了奥硝唑在人体内的代谢、排泄、药动学和转运机制，为其临床安全合理用药提供依据。<br>　　奥硝唑在人体内经历广泛代谢。采用U给药后的血浆、尿样和胆汁中共检测到1PLC-Q/TOF MS法在奥硝唑9种代谢产物:其中血浆中检测到7个代谢物，尿样中检测到19个代谢物，胆汁中检测到13个代谢物。通过合成或分离的手段获得了11种主要代谢物的对照品，经NMR确证了结构。由相应紫外检测色谱图判断，奥硝唑在血浆中的主要代谢产物包括M3（2'，3'-环氧代谢物）、M6（2'，3'-二醇代谢物）、M16-1（S-奥硝唑葡萄糖醛酸结合物，S-Glu）和M16-2（R-奥硝唑葡萄糖醛酸结合物，R-Glu）;尿中主要代谢产物包括M6、M10（硫酸结合物）、S-Glu和R-Glu;胆汁中主要代谢物包括M11（ω-半胱氨酸结合物）、S-Glu和R-Glu。采用UPLC-UV法对尿样中奥硝唑及其主要代谢物进行定量分析。静脉滴注500 mg奥硝唑氯化钠注射液后96 h内，尿中共回收了75.2％的剂量，其中原形奥硝唑回收了6.0％的剂量，表明奥硝唑在人体内主要经代谢清除后由尿排泄。尿中代谢物S-Glu、M6、M10、R-Glu、M17（羟基化葡萄糖醛酸结合物）、M14（ω-N-乙酰半胱氨酸结合物）和M7（ω-羧酸化代谢物）分别回收了总剂量的28.9％、11.6％、11.4％、8.4％、4.8％、2.9％和1.2％。奥硝唑葡萄糖醛酸结合物（S-Glu和R-Glu）共回收了总剂量的37.3％，表明葡萄糖醛酸结合途径是奥硝唑在人体内的主要代谢途径。另外，S-Glu尿中回收率约为R-Glu的3.4倍，提示奥硝唑人体内的葡糖糖醛酸结合过程具有立体选择性。<br>　　奥硝唑分子含有一个手性中心，在临床上通常以消旋体给药。研究表明，奥硝唑对映体药理活性相当，但右旋奥硝唑（R型）的中枢抑制作用要显著强于其左旋体（S型）。左旋奥硝唑已于2009年在中国批准上市。为研究奥硝唑对映体在人体内立体选择性药动学，我们建立了测定人血浆中奥硝唑对映体的手性LC-MS/MS分析方法，并进行了完整的方法学验证。化学合成了d5-奥硝唑作内标，100μL血浆样品经乙酸乙酯液-液萃取后，Chiral-AGP柱(150×4.0mm,5μm)进行分离，正离子MRM模式下进行检测。奥硝唑对映体在7.5 min内实现基线分离（Rs=2.0）。测定R-奥硝唑和S-奥硝唑的线性范围均为30.0～10000 ng/mL; LLOQ均为30.0 ng/ mL;日内、日间精密度(RSD％)均小于10.2％;准确度(RE％)在-5.4％和1.2％之间。6名健康受试者单次口服1000 mg奥硝唑片后，R-奥硝唑和S-奥硝唑的Tmax（1.17±0.41vs1.42±0.92h）和Cmax（7942±1303 vs7916±1613 ng/mL）无统计学差异，表明奥硝唑对映体的吸收过程不存在立体选择性;而R-奥硝唑在消除相任意时间点的血药浓度均高于其对映体，R-奥硝唑的血浆暴露量(AUC)约为S-奥硝唑的1.5倍，血浆清除率(CL/F)约为S-奥硝唑的0.67倍，此结果提示奥硝唑对映体在人体内存在立体选择性代谢过程。<br>　　为测定奥硝唑及其主要代谢物的人体药动学，我们建立了快速、灵敏、准确的LC-MS/MS同时测定人血浆中的奥硝唑及其主要代谢物M3、M6、S-Glu和R-Glu，并进行了完整的方法学验证。100μL血浆样品经乙腈沉淀蛋白处理后，使用Capcell PAK MG C18柱(100×4.6 mm，5μm)进行分离，正离子MRM模式下进行检测。奥硝唑及其主要代谢物之间均获得良好的色谱分离，预处理和测定过程中不存在相互干扰。奥硝唑、M3、M6、S-Glu和R-Glu的线性范围分别为100～30000、10.0～3000、5.00～200、3.00～900和3.00～900 ng/mL; LLOQ分别为100、10.0、5.00、3.00和3.00 ng/mL;日内、日间精密度(RSD％)均小于10.9％;精密度（RE％）在-0.5％和9.4％之间。6名健康受试者单次口服1000mg奥硝唑片后，M3、M6、S-Glu和R-Glu的系统暴露量分别为原形奥硝唑的19.4％、3.9％、2.3％和0.8％，M3为奥硝唑口服给药后体循环中最主要的代谢物。S-Glu体循环中暴露量约为R-Glu的5倍，表明奥硝唑人体内的葡萄糖醛酸结合过程具有立体选择性。<br>　　重组UGT底物筛查实验结果表明，UGT1 A9和UGT2B7分别是介导R-奥硝唑和S-奥硝唑葡萄糖醛酸结合过程的最主要酶。尼氟酸（UGT1A9化学抑制剂）和氟比洛芬（UGT2B7化学抑制剂）能显著抑制奥硝唑对映体在HLM和HKM体系中的葡萄糖醛酸结合过程。此外，R-奥硝唑和S-奥硝唑在相应重组酶体系中的Km（UGT1A9:15.6±1.6 mM; UGT2B7:3.8±0.9 mM）与其在微粒体体系中的Km（HLM:15.6±1.6mM和6.6±1.3 mM; HKM:17.7±4.0mM和3.2±0.4mM）十分接近，进一步佐证了以上结果。奥硝唑对映体在HLM和HKM体系中经葡萄糖醛酸结合代谢的清除率比（S/R）分别为4.3和6.5，表明S-奥硝唑在人体内的清除代谢过程要快于R-奥硝唑，这可能是奥硝唑在人体内立体选择性药动学的主要原因。通过well-stirred模型预测的组织清除率结果表明，肝脏是奥硝唑在人体的葡萄糖醛酸结合代谢的主要清除器官。但组织清除率预测结果仍一定程度上低估了其相应的血浆清除率，提示可能有转运体的参与。在HLM和原代肝细胞孵化体系中M3的生成量与不含酶体系中相当，表明M3的生成是一个非酶依赖的化学过程。此外，HLM和HLC均能催化M3向M6转化，推测M6在人体内主要由M3经mEH和sEH水解产生。<br>　　R-Glu和S-Glu在OAT3转染的HEK293细胞上的摄取速度分别为Mock细胞的100倍和214倍，并且其摄取过程均可被丙磺舒所阻断，表明R-Glu和S-Glu是OAT3转运体的敏感底物。摄取动力学实验结果表明，R-Glu在OAT3转染的HEK293细胞上摄取过程的Km（85.2±6.6 vs144±12μM）和Vmax(701±17 vs782±23 pmol/min/mg)均小于S-Glu，其摄取过程的清除率约为S-Glu的1.5倍，与二者在人体内的肾清除率(30.0 vs20.7 L/h)的差异一致，表明OAT3转运体介导的差异化的摄取过程是R-Glu和S-Glu在肾中立体选择性排泄过程的主要原因。因此，推测在肾功能不全患者体内两代谢物的排泄过程可能受阻，进而导致其血浆暴露量的大幅增加，临床上应关注这种暴露量增加所伴随的安全性风险。