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摘要背景:绝经后骨质疏松症(Postmenopausal osteoporosis，PMOP)是一类原发性骨质疏松症，主要发生在绝经后中老年妇女，是全球中老年女性人群中常见疾病之一，其引起的骨折及由此产生的相关疾病严重的影响了患者的生活，并造成了巨大的经济损失以及高额的医疗费用。目前，对于绝经后骨质疏松的治疗因缺乏有效的药物，故预防更为重要。通过对血清中的类固醇激素定性定量分析，能够更早发现疾病的异常变化，有助于对疾病产生机制研究、临床诊断以及医疗药物的开发。<br>　　目的:建立LC-MS/MS方法同时测定绝经后骨质疏松血清中16种类固醇激素（雄激素、雌激素、孕激素及皮质激素），并研究绝经后骨质疏松与类固醇激素之间的关系，探讨其因雌激素的降低，对类固醇激素整体水平的影响，为早期临床诊断和药物开发提供依据。<br>　　方法:(1) LC-MS/MS检测血清中类固醇激素（雄激素、孕激素和皮质激素）的方法学研究<br>　　取200μL血清样品，先用葡萄糖醛酸糖苷酶酶解，再用甲基叔丁基醚萃取后进行样品分析，以睾酮-d3作为内标。采用Kromasil C18色谱柱(2.1×150mm5μm)，乙腈—纯水（含0.1％乙酸）为流动相，梯度洗脱，流速0.30mL/min，柱温40℃，进样量6μL。在ESI源正离子模式下，选择多反应监测（MRM）模式。经检测，睾酮、表睾酮、二氢睾酮、雄酮、雄烯二酮、去氢表雄酮、孕酮、17-羟孕酮、醛固酮、可的松、皮质醇、皮质酮、11-脱氧皮质酮和内标的检测离子对分别为:m/z289.3→109.0、m/z289.3→253.3、m/z291.2→255.4、m/z273.3→147.1、m/z287.4→97.1、m/z289.3→271.1、m/z315.2→109.1、m/z331.2→97.0、m/z361.2→343.2、m/z361.2→163.1、m/z361.2→327.0、m/z347.2→329.1、m/z331.2→109.1和m/z292.0→109.3。通过专属性、精密度、准确度、回收率和基质效应、线性范围以及定量下限等进行方法考证。<br>　　(2)UPLC-MS/MS的血清中雌激素（雌酮、雌二醇和雌三醇）的方法学研究<br>　　取200μL血清样品，先用甲基叔丁基醚萃取，再用甲基叔丁基醚-二氯甲烷(2∶1)萃取，最后用丹磺酰氯衍生化后进行样品分析，以雌二醇-d3作为内标。采用Welch Ultimate UHPLC XB-C18色谱柱(2.1×50 mm1.8μm)，乙腈—纯水（含0.1％甲酸）为流动相，梯度洗脱，流速0.20mL/min，柱温40℃，进样量10μL。在ESI源正离子模式下，选择多反应监测(MRM)模式。经检测，雌酮、雌二醇、雌三醇及内标的检测离子对分别为:m/z504.0→171.0、m/z506.0→171.0、m/z522.0→171.0和m/z509.0→171.0。通过专属性、精密度准确度、回收率和基质效应、线性范围以及定量下限等进行方法考证。<br>　　(3)绝经后骨质疏松症与类固醇激素（雄激素、雌激素、孕激素及皮质激素）相关性研究<br>　　利用上述建立的LC-MS/MS分析方法，开展对36例绝经后骨质疏松症患者和40例绝经后正常女性血清中雄激素、雌激素、孕激素和皮质激素等类固醇激素的检测，数据均采用均差±标准差（Mean±SD）表示，并且使用多元数据结合T-Test作组间分析，比较两者血清中类固醇激素的差异。<br>　　结果:(1)该方法精密度、准确度、检测限和定量限均符合SFDA要求。血清中睾酮的线性范围为0.1～50 ng·mL-1;二氢睾酮和醛固酮的线性范围为0.25～20ng·mL-1;11-脱氧皮质酮和表睾酮的线性范围为0.5～50 ng·mL-1;雄酮、雄烯二酮和可的松的线性范围为2～200 ng·mL-1;去氢表雄酮的线性范围为20～2000ng· mL-1;孕酮的线性范围为0.5～50 ng·mL-1;17-羟孕酮的线性范围为0.2～20ng·mL-1;皮质醇的线性范围为5～500 ng·mL-1;皮质酮的线性范围为0.1～10ng· mL-1;在其检测范围内线性良好，相关系数均大于0.9936，提取回收率均大于70％，无明显基质效应，批内、批间RSD均小于10％;室温，冻融、进样盘及长期稳定性在低、中、高浓度的RSD、RE均在6％范围内;<br>　　(2)该方法精密度、准确度、检测限和定量限均符合SFDA要求。血清中雌酮、雌二醇和雌三醇的线性范围均在0.01～5 ng· mL-1范围内，在其检测线性范围内线性良好，相关系数均大于0.9914，提取回收率均大于65％，无明显基质效应，批内、批间RSD均小于7％;室温，冻融、进样盘及长期稳定性在低、中、高浓度的RSD均在7％范围内，RE均在8％范围内;<br>　　(3)利用第二章和第三章所建立的分析方法，运用T-Test分析，且与正常组相比，绝经后骨质疏松血清中雄烯二酮、去氢表雄酮和11-去氧皮质酮比绝经后正常女性血清浓度显著性降低(P＜0.05);睾酮、雄酮、孕酮、17羟孕酮、醛固酮、皮质醇和皮质酮有所降低;雌酮有所增加;雌二醇、雌三醇和可的松均没有明显变化;表睾酮和二氢睾酮由于在绝经后血清中含量较低未检测到。<br>　　结论:建立的类固醇激素（雄激素、雌激素、孕激素及皮质激素）的定量检测方法，稳定性好，提取回收率高，批内/批间精密度好，无明显的基质效应，能够满足生物样品分析要求，适合于绝经后骨质疏松血清的研究。类固醇激素的变化与绝经后骨质疏松存在相关性，睾酮、雄酮、雄烯二酮、孕酮、17羟孕酮、醛固酮、皮质酮、11-去氧皮质酮、皮质醇与绝经后骨质疏松呈负相关，而雌酮与绝经后骨质疏松呈正相关。对于解释类固醇激素的异常与绝经后骨质疏松症的研究有着重要的意义，为骨质疏松症临床诊断和新药开发提供有效的评价指标和新的研究思路。