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摘要本文分为以下几个部分进行探讨：<br>　　第一部分 糖尿病下肢血管病变球囊扩张术后再狭窄的机制及磺脲类药物对其影响<br>　　Ⅰ:糖尿病下肢血管病变球囊扩张术后再狭窄发生机制的研究<br>　　目的：<br>　　1、建立与人下肢血管病变PTA后再狭窄发病机制相似的动物模型;<br>　　2、同时构建动脉粥样硬化及再狭窄动物模型，并通过设定不同血糖分组对两者血管斑块行对比研究，以探索动脉粥样硬化及再狭窄发病机制的差异及高血糖状态对再狭窄的影响，更好的探究再狭窄发生机制。<br>　　方法：<br>　　1、实验分组及模型建立:<br>　　(1)糖尿病再狭窄vs.非糖尿病再狭窄;<br>　　(2)糖尿病动脉粥样硬化vs.非糖尿病动脉粥样硬化。<br>　　选取3月龄新西兰大耳白兔(～1.7kg)，使用普通饲料适应性喂养1周后，再进行高脂饲料喂养，直至实验结束。随机将实验兔分为4组:<br>　　①糖尿病再狭窄组:a.四氧嘧啶80mg/kg于耳缘静脉注射以建立1型糖尿病模型（实验第1周），b.球囊拉伤术建立髂动脉粥样硬化模型（实验第2周），c.超声检测球囊拉伤部位，观察拉伤部位动脉粥样硬化斑块形成情况（手术结束4周，实验第6周），d.对髂动脉粥样硬化斑块形成部位行PTA手术（实验第6周），建立再狭窄模型;<br>　　②非糖尿病再狭窄组:a.生理盐水于耳缘静脉注射（实验第1周），b.球囊拉伤术建立髂动脉粥样硬化模型（实验第2周），c.超声检测球囊拉伤部位，观察拉伤部位动脉粥样硬化斑块形成情况（手术结束4周，实验第6周），d.对髂动脉粥样硬化斑块形成部位行PTA手术（实验第6周），建立再狭窄模型;<br>　　③糖尿病动脉粥样硬化组:a.四氧嘧啶80mg/kg于耳缘静脉注射建立1型糖尿病模型（实验第1周），b.超声检测髂动脉血管通畅状况（实验第6周），c.球囊拉伤术建立髂动脉粥样硬化模型（实验第6周）;<br>　　④非糖尿病动脉粥样硬化组:a.生理盐水于耳缘静脉注射（实验第1周），b.超声检测髂动脉血管通畅状况（实验第6周），c.球囊拉伤术建立髂动脉粥样硬化模型（实验第6周）。<br>　　2、糖化血红蛋白检测:实验结束留取动物血样标本测定糖化血红蛋白。<br>　　结果：<br>　　1、动物一般情况<br>　　各组实验兔随机血糖基线水平一致。糖尿病组实验兔耳缘静脉注射四氧嘧啶1周后，糖尿病模型成功率～66.7％。实验结束前，2只糖尿病动脉粥样硬化组实验兔及1只糖尿病再狭窄组实验兔死于高血糖;2只非糖尿病动脉粥样硬化组实验兔及1只非糖尿病再狭窄组实验兔死于超声检查;1只非糖尿病再狭窄组实验兔及2只糖尿病动脉粥样硬化组实验兔死于血栓。<br>　　2、各组实验兔体重及血糖情况<br>　　各组实验兔体重在开始实验及结束实验时水平大致相同，均无明显差异(P＞0.05)。建模前各组实验兔之间血糖水平无差异，四氧嘧啶注射1周后糖尿病组实验兔整体血糖水平升高，直至实验结束均明显高于非糖尿病组，有统计学意义(P＜0.05);相同血糖类型模型下的实验兔血糖之间无差异（糖尿病再狭窄组vs.糖尿病动脉粥样硬化组，P＞0.05;非糖尿病再狭窄组与非糖尿病动脉粥样硬化组，P＞0.05）。实验结束对各组实验兔糖化血红蛋白进行检测，其结果同各组血糖所反映的状况一致。<br>　　结论：<br>　　1、本研究通过模拟人下肢血管病变PTA后血管损伤过程，对具有动脉粥样硬化病变的血管行PTA手术，成功建立与人下肢血管病变PTA后再狭窄相似的理想动物模型。<br>　　2、高糖虽是动脉粥样硬化斑块形成的独立风险因素，对再狭窄的发生、发展却影响不大，造成这种差异的主要原因可能是动脉粥样硬化与再狭窄发生机制的不同。<br>　　Ⅱ:磺脲类药物对血管平滑肌细胞迁移增殖的影响<br>　　目的：<br>　　1、在体外细胞水平，研究不同SUs对VSMCs增殖及迁移能力的影响。<br>　　2、探究不同SUs对VSMCs迁移增殖调控机制。<br>　　方法：<br>　　1、人主动脉平滑肌细胞(HA-VSMC)培养及分组:<br>　　HA-VSMC细胞株购自美国ScienCell公司，取第4-6代应用于后续实验。实验分组如下:<br>　　①Control组;②格列美脲组;③格列本脲组;④格列齐特组。<br>　　2、免疫荧光方法检测HA-VSMC细胞株SUR2表达<br>　　采用细胞免疫荧光法，检测HA-VSMC膜表面SUR2的表达。<br>　　结果：<br>　　1、免疫荧光方法对HA-VSMC细胞株SUR2表达检测:HA-VSMC细胞表面有丰富的SUR2表达。<br>　　2、SUs药物剂量选取结果<br>　　对格列美脲、格列本脲及格列齐特处理的HA-VSMC活力进行检测并计算其抑制率，取IC10进行后续实验:格列美脲浓度为208μM、格列本脲21μM、格列齐特2000μM。<br>　　结论：<br>　　1、不同SUs对VSMCs迁移增殖的影响不同，在本实验所选取的常用SUs中，格列本脲和格列美脲对VSMCs的迁移及增殖起到促进的作用，格列本脲的促进作用更为显著，格列美脲次之，KATP通道开关状态在其中扮演着重要角色。<br>　　2、格列齐特对VSMCs迁移增殖表现为抑制作用，机制可能与其SUR选择性，及在VSMCs上调控NF-κB通路的活性相关。<br>　　第二部分 磺脲类药物——格列齐特的胰腺外降糖作用及机制研究<br>　　目的：<br>　　1、阐明格列齐特体内胰腺外降糖作用的存在。<br>　　2、探究格列齐特胰腺外降糖作用的机制。<br>　　方法：<br>　　1、SUR1基因敲基因大鼠的构建及培养:构建SUR1基因敲除大鼠(TALEN基因敲除技术)。并通过筛选和育种，获取SUR1-/-大鼠。<br>　　2、2型糖尿病模型建立及实验分组<br>　　健康雄性SUR1-/-大鼠，体重～120g左右。高脂饲料喂养，4周后行腹腔葡萄糖耐量试验(intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)及胰岛素耐量试验（intraperitoneal insulin tolerance test，IPITT），选取建立胰岛素抵抗的SUR1-/-鼠给予腹腔一次性注射27.5mg/kg链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)。继续高脂喂养2周后测定空腹血糖，连续两次空腹血糖≥11.1 mmol/l，且伴有多饮、多食、多尿症状的大鼠被认为建模成功。<br>　　成功建立2型糖尿病的SUR1-/-鼠再次行IPGTT及IPITT检测，并随机分为3组:①格列齐特组（Gliclazide组，10mg/kg/d）;②二甲双胍组(Metformin，212.5mg/kg/d);③对照组（Control组）。通过灌胃的方式给药，Control组给予生理盐水灌胃，喂药时间2周。2周后重复IPGTT及IPITT检测，并对各组实验鼠行高胰岛素-正常血糖钳夹实验，钳夹结束后将动物安乐死，取材。<br>　　结果：<br>　　1、SUR1敲基因大鼠构建及SUR1-/-鼠培育:Abcc8（SUR1）基因敲除，成功构建TALEN载体、线性化载体并倒入胚胎干细胞、成功筛选同源重组的胚胎干细胞、通过显微注射方式将胚胎干细胞导入囊胚、成功获取嵌合体大鼠并与野生型大鼠杂交获取杂合体大鼠、再次杂交获取SUR1-/-大鼠。<br>　　采用PCR、Sanger测序及western blot方法证实SUR1-/-大鼠获取成功。<br>　　2、动物一般情况<br>　　大鼠喂养高脂饲料4周后，经测定全部产生胰岛素抵抗。STZ注射后，共27只大鼠血糖达到2型糖尿病模型建立标准，血糖未达标的大鼠被排除出实验。格列齐特组及对照组分别有1只实验鼠在实验未完成前死亡，死因不详。<br>　　结论：<br>　　1、格列齐特除传统的促胰岛β细胞分泌胰岛素降糖作用外，还具有胰腺外降糖作用。<br>　　2、格列齐特胰腺外改善血糖代谢及胰岛素抵抗的能力较二甲双胍弱，其胰腺外降糖作用机制与二甲双胍不同，二甲双胍主要是缓解肝脏组织胰岛素抵抗，格列齐特则主要是缓解肌肉及脂肪组织胰岛素抵抗。<br>　　3、格列齐特能明显促肌肉及脂肪组织中GLUT4的表达及转位，其作用机制可能与PPAR-γ及Akt通路激活有关。<br>　　SUs一直被认为是通过胰岛素促泌作用来降低血糖，缓解糖尿病患者病情。本研究通过将SUs胰岛β细胞上作用受体基因——SUR1敲除，SUR1表达缺失，SUs促胰岛素分泌作用被阻断，观察第二代SUs——格列齐特对SUR1基因敲除后2型糖尿病大鼠的影响。证实格列齐特在失去促胰岛β细胞分泌胰岛素降糖能力后，仍然可以直接作用于外周组织，缓解胰岛素抵抗状况，改善糖代谢。明确其同时具有促胰岛素分泌降糖及缓解胰岛素抵抗降糖两方面作用，为今后的用药指导提供依据。