检索历史 清除

摘要本文分为以下几个部分进行探讨：<br>　　第一部分 人副流感病毒3型F蛋白DⅠ-DⅡ连接区对膜融合功能的影响及机制研究<br>　　目的:<br>　　确定HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅡ连接区对膜融合活性的影响，探讨DⅠ-DⅡ连接区影响膜融合功能的机制，以期为研究安全有效的疫苗和抗病毒药物提供线索。<br>　　方法:<br>　　1.采用蛋白同源建模的方法在SWISS-MODEL软件上以PIV5(PIV5)F蛋白融合前构象的晶体结构(PDB ID:4GIP)为模板得到HPIV3 F蛋白的融合前构象的模型，以确定DⅠ-DⅡ连接区在融合前构象上的位置。<br>　　2.采用定点突变和体内同源重组相结合的方法构建出该区域(369aa-374aa)的九个单氨基酸突变体，测序确定构建成功后将它们在真核瞬时表达系统内进行蛋白表达。<br>　　3.采用三种不同类型的膜融合试验，即吉姆萨染色法，指示基因法，染料转移法，定性和定量检测各突变体蛋白对膜融合功能的影响。<br>　　4.采用流式细胞术来检测各突变体F蛋白在细胞表面的表达效率。<br>　　5.采用免疫共沉淀试验来检测各突变体F蛋白与HPIV3 HN蛋白在细胞表面的相互作用能力。<br>　　6.采用SPSS17.0软件进行数据处理，应用Student's t-检验对突变体和野生型F蛋白的实验数据进行分析比较，P＜0.05被认为差别具有统计学意义。<br>　　结果:<br>　　1.成功构建出HPIV3 F蛋白融合前构象的同源结构模型，通过氨基酸序列比对确定了HPIV3 F蛋白融合后构象的DⅠ-DⅡ连接区（369-374aa）在它的融合前构象中仍然扮演DⅠ-DⅡ连接区的角色。HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅡ连接区的9个单氨基酸突变体(K369A、K369E、S370A、D371A、I372A、V373A、V373T、P374A和P374T)均构建成功。<br>　　2.各突变体F蛋白在膜融合过程的所有阶段均表现出降低的膜融合活性。与野生型蛋白相比，突变体F蛋白形成的合胞体不仅数目减少而且面积也较小，其中K369E、S370A、V373A、V373T和P374T突变体几乎丧失了形成合胞体的能力，仅为野生型的5％以下，内容物混合的能力也极度降低，分别为野生型的18.0％、17.3％、16.4％、18.9％和15.4％，同时它们的半融合活性也大幅度降低，半融合的速率和程度均低于野生型水平的15％;而剩下的4个突变体（K369A、D371A、I372A和P374A）虽具有合胞体形成能力，但均低于野生型水平，其中K369A和D371A突变体内容物混合的能力均约为野生型的66.7％，半融合的速率和程度约为野生型水平的五分之四(82.2％、82.0％)和四分之三(74.5％、75.2％)，而I372A和P374A突变体内容物混合的能力分别为野生型的水平的57.6％和54.5％，半融合的速率分别降低到野生型水平的58.5％和51.8％，半融合的程度分别降低为野生型的62.6％和60.6％。<br>　　3.DⅠ-DⅡ连接区的突变对F蛋白在细胞表面的表达水平无影响。各突变体F蛋白在细胞表面的表达水平均处于野生型F蛋白的93.1％～105.9％之间，与野生型相比差别无统计学意义(P＞0.05)。<br>　　4.DⅠ-DⅡ连接区的各突变体与HPIV3 HN蛋白在细胞表面的相互作用能力均降低，其中K369E、V373A、V373T和P374T这4个突变体几乎丧失了与HN蛋白相互作用的能力，均低于野生型水平的10％; S370A突变体与HN蛋白相互作用的能力约为野生型的五分之一;K369A、D371A、I372A和P374A突变体与HN蛋白相互作用的能力分别为野生型的41.4％、66.0％、26.9％和15.2％。<br>　　结论:<br>　　HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅡ连接区对膜融合功能有重要影响，且各氨基酸残基对膜融合活性影响的程度不同。膜融合活性的降低可能是由于突变导致各突变体F蛋白与同源性HN蛋白在细胞表面的相互作用能力降低所致。<br>　　第二部分 人副流感病毒3型F蛋白DⅠ-DⅢ伪连接区亮氨酸拉链类似结构对膜融合功能的影响及机制研究<br>　　目的:<br>　　确定HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅢ伪连接区亮氨酸拉链类似结构对膜融合活性的影响，寻找亮氨酸拉链类似结构干扰膜融合功能的机制。<br>　　方法:<br>　　采用PCR定点突变和体内同源重组相结合的方法将该区域的亮氨酸和其它保守氨基酸（L257、V264、L271、L278、L285、Q292和I299）分别突变为丙氨酸，同时将中间的三个高度保守的亮氨酸（L271、L278和L285）进行了联合突变，应用痘苗病毒-T7 RNA聚合酶瞬时表达系统于BHK-21细胞内进行蛋白表达，之后采用合胞体形成试验、内容物混合试验、R18探针试验，半融合动力学试验检测突变对膜融合功能的影响;采用流式细胞术检测各突变体F蛋白在细胞表面的表达水平;采用免疫共沉淀试验来检测突变对HN蛋白和F蛋白在细胞表面的相互作用能力的影响。采用SPSS17.0软件进行数据处理，应用Student，st-检验对突变体和野生型F蛋白的实验数据进行分析比较，P＜0.05被认为差别具有统计学意义。<br>　　结果:<br>　　1.应用PCR单点突变和联合突变的方法成功构建出了HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅢ伪连接区亮氨酸拉链类似结构的7个单点突变体(L257A、V264A、L271A、L278A、L285A、Q292A和I299A)、3个二联突变体(L271A-L278A、L271A-L285A和L278A-L285A)和1个三联突变体(L271A-L278A-L285A)。<br>　　2.各突变体F蛋白与HPIV3 HN蛋白共表达时，在膜融合过程的所有阶段均表现出降低甚至消失的膜融合活性。与野生型相比，突变体蛋白形成的合胞体不仅数量减少而且面积也较小，3个单点突变体（L257A、L271A和I299A）和3个二联突变体的合胞体形成能力极度降低，低于野生型水平的6.0％，内容物混合的能力只有野生型水平的16.0％以下，且只观察到极少量的半融合事件，半融合的速率和程度均低于野生型水平的9.5％;而V264A、L285A和Q292A这3个突变体的合胞体形成能力略微降低，分别为野生型水平的64.7％、69.1％和68.5％，内容物混合的能力仍维持在野生型水平的85％左右，介导半融合能力轻微降低，半融合的速率分别为野生型的88.8％、87.6％和85.0％，半融合的程度分别为野生型的85.5％、87.2％和83.1％;此外，L278A突变体的合胞体形成能力约为野生型水平的38.1％，内容物混合的能力只有野生型的一半，半融合的速率和程度分别为野生型水平的52.8％和60.6％;剩下的三联突变体丧失了合胞体形成能力，内容物混合能力仅为野生型的2.2％，也没有观察到半融合事件的发生，半融合的速率和程度均低于野生型水平的9.5％。<br>　　3.HPIV3 F蛋白亮氨酸拉链类似结构的各丙氨酸取代株在细胞表面的蛋白表达水平均与野生型近似，差别无统计学意义(P＞0.05)。<br>　　4.所有的突变体F蛋白与HPIV3 HN蛋白在细胞表面的相互作用能力均降低，其中三联突变体没有检测到与HN蛋白的相互作用;3个二联突变体与HN蛋白的相互作用能力约为野生型的一半;L257A、L271A和I299A突变体与HN蛋白的相互作用能力低于野生型水平的30％;V264A、L278A、L285A和Q292A突变体与HN蛋白的相互作用能力分别为野生型水平的63.3％、65.1％、64.3％和66.7％。<br>　　结论:<br>　　HPIV3 F蛋白DⅠ-DⅢ伪连接区的亮氨酸拉链类似结构对膜融合活性有重要影响;其中三联突变体对膜融合活性的影响最大;该结构的完整性是完成膜融合过程必不可少的。<br>　　第三部分 人副流感病毒3型F蛋白HRB连接区对膜融合功能的影响及机制研究<br>　　目的:<br>　　确定HPIV3 F蛋白HRB连接区对膜融合功能的影响，探讨该区域影响膜融合功能的机制。<br>　　方法:<br>　　采用定点突变和体内同源重组相结合的方法将HRB连接区内的T429、E432、I443和N446位氨基酸进行单点突变，应用痘苗病毒-T7 RNA聚合酶瞬时表达系统于BHK-21细胞内进行蛋白表达，之后采用吉姆萨染色法、指示基因法、染料转移法检测突变对膜融合活性的影响;采用SPSS17.0软件进行数据处理，应用Student's t-检验对突变体和野生型F蛋白的实验数据进行分析比较， P＜0.05被认为差别具有统计学意义。<br>　　结果:<br>　　1.成功构建了HRB连接区的6个突变体T429A、T429L、E432A、I443A、N446A和N446S。<br>　　2.各突变体F蛋白与HPIV3 HN蛋白共表达时，膜融合活性表现为两种类型。T429A、T429L和N446A这3个突变体形成的合胞体不仅个数少，而且面积也比较小，内容物混合的能力也降低，只有野生型水平的36.6％、42.3％和15.2％，同时半融合活性只有野生型水平的34.8％、42.7％和12.4％;而E432A、I443A和N446S这3个突变体的膜融合活性均比野生型略增强，分别相当于野生型的109.4％、113.2％和118.6％，但半融合活性差别无统计学意义。<br>　　结论:<br>　　HPIV3 F蛋白HRB连接区内的氨基酸突变对细胞融合活性有重要影响，其中N446为关键氨基酸位点。