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摘要本文从以下两部分进行论述：<br>　　第一部分 SPINK1基因内含子区域的突变鉴定及其对mRNA前体剪接功能的影响<br>　　目的：<br>　　本课题组前期已经成功构建SPINK1野生型表达质粒，应用该模型分析内含子突变对剪接影响的功能实验也是本课题的主要研究目的之一。本课题的另一个主要研究目的是以期在家族性慢性胰腺炎患者中进一步筛选新的SPINK1内含子突变，并体外分析内含子突变对mRNA前体的剪接影响，从而为慢性胰腺炎的遗传致病机制提供重要的实验依据。<br>　　方法：<br>　　1.含全长SPINK1基因组序列的野生型载体构建:使用载体为pcDNA3.1/V5-His-TOPO，含SPINK1从翻译起始子至终止子的全长基因组序列，总长度为12.5 kb。<br>　　2.靶向测序SPINK1基因的内含子序列以筛选新突变:在Emmanuelle Masson博士的协助下，我们对法国家族性慢性胰腺炎患者全面分析4个已知致病基因（PRSS1，SPINK1，CTRC和CPA1）的外显子和及其侧翼序列，对于未发现任何已知致病突变的患者，我们设计了两次相互交叉的长片段PCR反应，扩增SPINK1基因所有内含子区域，并对PCR产物进行一代测序。<br>　　3.Quikchange定点突变导入:设计定点突变引物及其相应测序引物，使用QuikchangeⅡ XL试剂盒，将内含子突变导入SPINK1野生型载体中，并转化XL10-Gold超级感受态细胞。<br>　　4.将患者来源的SPINK1全长基因组序列克隆入表达质粒:对于定点突变导入失败的突变，我们从对应患者的DNA中扩增出SPINK1全长基因组序列，然后再与pcDNA3.1/V5-His-TOPO连接。<br>　　5.细胞培养和转染:3×105的HEK293T细胞加入6孔细胞培养板进行铺板，将1μg质粒（野生型和突变型）和3μL脂质体在Opti-MEM充分混匀后，转染HEK293T细胞。<br>　　6.RNA提取和逆转录PCR:转染48小时后，使用总RNA提取试剂盒对HEK293T细胞进行提取。使用SuperScriptTMⅡ逆转录酶将RNA逆转录为cDNA，然后使用特异引物扩增SPINK1转录后的产物。<br>　　7.通过Alamut2.3（Interactive Biosoftware，France）软件分析，评估所有突变对SPINK1转录过程中潜在的剪接效应。对于Alamut软件预测存在异常剪接可能的突变，进一步使用定量PCR分析比较突变型与野生型质粒的SPINK1转录水平差异。<br>　　结果：<br>　　1.成功构建SPINK1内含子剪接功能分析模型(pcDNA3.1_SPINK1-WT)，结果发现c.194+2T＞C出现两条转录本，测序证实发生部分外显子3的跳跃。2个SNP位点均只出现一条正常转录本。<br>　　2.体外实验证实c.87+1G＞A存在异常剪接，发生全部外显子2的缺失。并证实Sahin-Tóth数据库中报道的7个未知突变均只出现一条与野生型相当的正常转录本。<br>　　3.有39例法国家族性CP患者未携带任何已知致病性突变，一代测序分析发现13个内含子突变，3个为已知突变，剩余10个为新发现突变，功能分析证实均只出现一条与野生型相当的正常转录本。<br>　　4.使用Alamut2.3软件对23个非剪接位点突变的进行异常剪接预测，结果发现c.194+13T＞G分值最高为4分，c.195-323 C＞T为3分，c.194+1504A＞G为3分，c.87+363A＞G为2分，c.195-1399G＞A仅为1分，剩余18个突变预测均不可能发生异常剪接。<br>　　5.选择4个预测分值≥2分的突变进行定量PCR分析，c.194+13T＞G突变质粒比野生型质粒的mRNA转录水平稍低，相对定量比值为0.88±0.14，P=0.29。c.195-323C＞T相对定量比值为1.07±0.13，P=0.42。c.87+363A＞G相对定量比值为1.02±0.06，P=0.62。c.194+1504A＞G相对定量比值为1.13±0.09，P=0.12。<br>　　6.c.194+13T＞G突变质粒发生少量异常剪接。ESEfinder进行预测，发现突变后新增2个ESE结合区域，即SRp40和SF2/ASF。通过特异引物扩增，得到异常条带，并经一代测序证实，该条带来自异常转录本，在突变位置新产生一个剪接供体位点GU，使下游12个碱基与外显子3共同发生剪接。<br>　　结论：<br>　　1.我们构建的含SPINK1基因全长的载体模型，与体内转录情况高度相似。证实c.194+2T＞C突变存在一条异常转录本（外显子3缺失）。GC也可以作为剪接供体位点，但其与受体位点AG发生结合的作用可能要比GU弱。<br>　　2.体外实验证实c.87+1G＞A发生异常剪接，即全部外显子2缺失，AT不能作为剪接供体位点。c.194+13T＞G直接产生一个新的剪接供体位点GU，竞争性出现少量异常转录本。<br>　　3.体外证实了Sahin-Tóth数据库中报道的SPINK1基因6个未知内含子突变和10个新突变均为非致病性突变，可以排除这些突变的疾病相关性。<br>　　4.在筛查致病突变时，尽管应优先考虑外显子的序列，但是不能忽略内含子区域的突变，尤其是在外显子-内含子交界区。<br>　　第二部分 CEL-HYB杂合等位基因变异在中国人群中的发生率及其功能研究<br>　　目的：<br>　　研究目的是检测CEL-HYB变异在中国人群的发生率，进而有利于明确该变异直接的致病性;另一方面，探索是否存在中国人群特异的CEL-HYB变异类型，并进行功能分析。<br>　　方法：<br>　　1.研究对象:在获得患者知情同意下，收集患者临床资料和血标本，共计入选799例中国特发性CP患者和1028例正常对照。<br>　　2.我们对之前报道的长片段、双重PCR检测方法稍作改进，在所有病例组和对照组中进行CEL-HYB杂合等位基因筛查。若为阳性样品，使用一代测序的方法进行验证和分型。<br>　　3.使用相应变异携带者的DNA做为模板，PCR扩增后导入pcDNA3.1质粒中，分别构建含全长CEL-HYB1和中国人群特异的CEL-HYB类型基因组DNA序列的表达载体。<br>　　4.细胞转染和放线菌酮处理:将两种pcDNA3.1-CEL-HYB质粒分别对HEK293T细胞进行转染，用于常规RT-PCR分析。将变异质粒与pGL3-GP2参考小基因共同转染HEK293T细胞，用于定量RT-PCR分析。提取RNA4小时前，加入最终浓度为50μg/mL放线菌酮(CHX)处理。<br>　　5.对CEL-HYB转录后的mRNA进行逆转录，以cDNA为模板，分别构建含两种质粒转录后cDNA的蛋白表达载体，用于Western blot分析。<br>　　结果：<br>　　1.中国人群中，CEL-HYB变异在特发性CP患者中的检出率为2.4％，对照组中为1.9％，两组差异没有统计学显著性。<br>　　2.对阳性样品一代测序，并没有检测出欧洲人群特异的变异（即CEL-HYB1），我们将新发现的变异命名为CEL-HYB2，后者可分为两种亚型:CEL-HYB2a，共计38例(97.4％);CEL-HYB2b，仅1例患者(2.6％)。两种亚型的区别在于3个SNP位点差异，前者分别为rs10901232A/G为G，rs10901233C/T为T，rs671412A/G为G，后者则为其对应碱基(A，C，A)。<br>　　3.CEL-HYB1和CEL-HYB2a载体转染HEK293T细胞，并从中提取mRNA，结果发现CEL-HYB2a表达载体的mRNA转录水平明显比CEL-HYB1低(P=0.0004)。<br>　　4.CEL-HYB2a质粒转染HEK293T细胞时，加入放线菌酮(CHX)50mg/mL治疗4小时，定量PCR分析发现相比加药前，CEL-HYB2a加药后的mRNA相对值为186.0-±8.1，转录水平明显上升，P=0.003。<br>　　5.两种cDNA-CEL-HYB质粒分别对HEK293T细胞进行转染，初步实验结果发现，cDNA-CEL-HYB1在细胞内外均有蛋白表达，大小约为70 kDa。而cDNA-CEL-HYB2a仅在细胞内检测到蛋白质表达，且其表达量明显低于cDNA-CEL-HYB1。<br>　　结论：<br>　　1.CEL-HYB杂合等位基因在中国人群中并未发现CEL-HYB1型，而主要是CEL-HYB2a型，且在CP患者与对照之间无明显差异，提示其可能是一个欧洲人群特异的疾病危险因子。<br>　　2.CEL-HYB2a杂合等位基因经体外功能实验证实，发生无义介导的mRNA降解(NMD)，因此我们认为其与慢性胰腺炎致病无明显相关性。<br>　　3.mRNA发生NMD的可能性与提前终止子的位置相关，当其位于最后一个外显子时，更容易发生NMD逃逸。