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摘要肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一种致死性的神经退行性疾病，通常累及大脑皮质、脑干和脊髓前角的上、下运动神经元，导致肌肉无力和萎缩、言语困难及呼吸功能障碍。目前，全世界已发现的ALS致病基因主要有30余个，SOD1、FUS、TARDBP和C9ORF72基因最为常见。其中，C9ORF72基因非编码区的六核苷酸重复扩增突变GGGGCC(G4C2)是西方国家ALS与额颞叶痴呆（frontotemporal dementia，FTD）的最主要原因。此外，ATXN2基因编码区的三核苷酸(CAG)n重复扩增也是ALS发病的风险因素之一。<br>　　目的：<br>　　(1)应用高通量测序技术检测ALS目标基因突变，明确ALS患者常见的突变基因及其突变率。<br>　　(2)检测C9ORF72基因的非编码区G4C2突变和编码区突变，初步分析C9ORF72基因在ALS中发挥的作用。<br>　　(3)明确ATXN2，ATXN3，AR基因编码区和ATXN8基因非编码区的(CAG)n重复扩增与ALS是否有关。<br>　　方法：<br>　　(1)应用Ion Torrent测序平台进行靶向重测序，目标基因panel包括26个ALS明确致病基因及相关易感基因的全部外显子区域。筛选ALS候选致病基因突变及初步分析其致病性，明确常见突变基因及突变频率。<br>　　(2)采用Repeat-primed PCR扩增C9ORF72基因G4C2重复扩增区域，使用ABI3730 DNA Analyzer仪器和GeneMapper软件分析G4C2重复次数。通过体内cDNA测序和体外Minigene检测两种方法确定C9ORF72基因的剪接位点变异c.601-2 A＞G的致病性。<br>　　(3)扩增ATXN2、ATXN、ATXN和AR基因的(CAG)n重复扩增区域，确定(CAG)n在ALS患者和健康对照中的重复次数，通过统计学方法分析(CAG)n重复扩增突变与ALS是否有关。<br>　　结果：<br>　　(1)我们在7例FALS患者(38.89％，7/18)和33例SALS患者(18.54％，33/178)中检测到36种基因突变类型，包括1个剪接位点突变，1个无义突变和34个错义突变。FALS患者携带的基因突变分布在ALS明确致病基因SOD1、UBQLN2和VAPB中，其中突变频率最高的基因为SOD1(27.78％)。SALS患者中14例(7.87％，14/178)携带ALS明确致病基因的突变，SOD1突变频率最高。其余19例SALS患者(10.67％，19/178)携带ALS相关基因的突变，其中频率最高的是NEFH(3.93％)。<br>　　(2)我们发现2例SALS患者(0.79％，2/252)携带C9ORF72基因的G4C2重复扩增突变（大于30次）。统计学分析结果显示该重复扩增突变在中国ALS患者和健康对照中的分布情况没有显著性差异(p=0.805)。此外，我们发现了C9ORF72基因的一个剪接位点突变(c.601-2A＞G)。体内cDNA测序及体外MiniGene实验结果均显示出该突变破坏了第4内含子中的剪接受体位点，使第5外显子中隐匿剪接受体位点激活，可能导致成熟mRNA中缺失四个核苷酸(c.601_604 del ATAG)，读码框发生移位并提前出现终止密码(p.I201fsX235); cDNA测序结果还显示出无义介导的mRNA降解(Nonsense-Mediated mRNA Decay，NMD)。该突变为C9ORF72基因编码区突变的首次发现，也为Loss-of-Function致病机制提供新证据。<br>　　(3)我们发现ATXN2基因的(CAG)n长片段重复（＞32次）在ALS患者和正常人中分布有显著性差异(p=0.028)，而中间片段（24-31次）没有(p=0.839); ATXN8基因的(CAG)n中间片段（29-67次）和ALS疾病有关(p=0.0130);ATXN3和AR基因的长片段、中间片段和短片段重复均和ALS无关。<br>　　结论：<br>　　(1)本研究发现FALS和SALS患者中突变频率最高的基因均为SOD1，FALS和SLAS突变谱存在明显差异。<br>　　(2)C9ORF72基因的六核苷酸重复扩增突变G4C2不是中国ALS患者的常见基因突变类型。<br>　　(3)发现一个C9ORF72基因剪接位点突变c.601-2A＞G，为ALS的Loss-of-Function致病机制增加新证据。<br>　　(4)ATXN2基因的(CAG)n长片段（＞32次）和ATXN8基因的中间片段（29-67次）可能与ALS有关。ATXN和AR基因的(CAG)n突变与ALS无关。