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摘要背景:蛇毒去整合素（disintegrin）大部分富含半胱氨酸，分子量约5-9kDa，其典型特征是含有RGD(Arg-Gly-Asp)或KGD(Lys-Gly-Asp)模体。大部分整合素识别RGD序列，而大多数细胞外基质都含RGD序列，因此RGD成为细胞外基质与细胞整合素结合的重要位点。去整合素通过与细胞外基质竞争性结合细胞表面的整合蛋白受体来阻断肿瘤细胞与细胞外基质的黏附，而发挥抑制肿瘤作用。rAdinbitor为本组从旅顺白眉蝮蛇毒腺中获得的由73个氨基酸残基（含12个半胱氨酸残基）组成的重组蛋白，含去整合素的典型RGD模体。前期结果表明，rAdibitor能抑制C6胶质瘤、B16黑色素瘤、胃癌、肝癌细胞的增殖、黏附、迁移和侵袭以及血管新生能力，促进细胞凋亡。然而，rAdibitor作用于肿瘤细胞的分子机制尚不清楚。本论文研究rAdinbitor对鼠肝癌低淋巴道转移力Hca-P细胞的增殖、黏附、迁移、侵袭及凋亡的影响及相关分子机制。Hca-P是小鼠肝癌腹水型细胞，具有一定的淋巴结转移潜能，是研究肿瘤淋巴道转移的理想细胞模型。<br>　　接头蛋白CRK作为一种癌基因产物发现于禽类肉瘤病毒CT10(chickentumor10)中，由SH2和SH3结构域组成，包括CRKⅠ、CRKⅡ和CRKL三个成员。CRK家族通过酪氨酸激酶和小G蛋白等信号分子来调控细胞转录、骨架重组及增殖、分化和凋亡等。CRKⅠ是CRK家族成员，分子量为28kDa，编码202个氨基酸，含1个SH2和1个SH3结构域。大量研究表明CRKL和CRKⅡ异常表达与肿瘤发生发展有密切联系，而CRKⅠ与肿瘤关系研究较少。本论文通过在小鼠肝癌Hca-P中过表达CRKⅠ，研究其对细胞增殖、黏附、迁移和侵袭能力的影响，探讨其所作用的分子调控机制及其与rAdinbitor调控机制的内在联系。<br>　　目的:1.探讨rAdinbitor对Hca-P细胞增殖、黏附、迁移、侵袭能力的抑制及分子机制。2.探讨CRKⅠ过表达对Hca-P细胞增殖、黏附、迁移、侵袭能力的影响。3.探讨rAdinbitor调控的信号通路与CRKⅠ作用分子机制间联系。<br>　　方法:1.金属离子螯合层析纯化rAdinbitor;2.CCK-8法检测rAdinbitor对Hca-P毒性、Hoechst33258法检测细胞凋亡、Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭能力、小鼠淋巴结黏附实验检测细胞黏附能力;3.Western Blot法检测rAdinbitor作用于Hca-P细胞后，对CRK/DOCK180/Rac、MEK/ERK和PI3K/Akt/mTOR通路中信号分子表达水平影响;4.Western blot检测CRKⅠ蛋白过表达水平;5.台盼蓝计数法检测CRKⅠ过表达Hca-P的增殖能力、Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭能力、小鼠淋巴结黏附实验检测细胞黏附能力、台盼蓝拒染实验检测饥饿处理的细胞生存活力;6.小鼠足垫种植实验检测CRKⅠ过表达对Hca-P体内足垫成瘤能力和淋巴结转移能力的影响。<br>　　结果:1.rAdinbitor纯度均一;2.rAdinbitor对Hca-P增殖具有抑制作用，随药物浓度增加而增加;rAdinbitor对Hca-P作用48h的IC50值～40μM;rAdinbitor剂量依赖性促进Hca-P凋亡;rAdinbitor明显抑制Hca-P迁移和侵袭能力;rAdinbitor对Hca-P淋巴结黏附能力具明显抑制作用;3.rAdinbitor作用Hca-P后，CRK/DOCK180/Rac、MEK/ERK和PI3K/Akt/mTOR通路中信号分子表达水平有不同程度降低，随药物浓度增加，下降程度愈加明显;4.稳定转染的单克隆细胞中CRKⅠ表达水平明显提高;5.CRKⅠ过表达显著促进Hca-P的体外增殖、迁移、侵袭、淋巴结黏附能力和生存活力;6.CRKⅠ过表达显著促进Hca-P体内足垫成瘤和淋巴结转移能力。<br>　　结论:1.rAdinbitor抑制Hca-P增殖并促其凋亡，IC50约40μM;2.rAdinbitor抑制Hca-P体外黏附、迁移和侵袭能力;3.rAdinbitor通过调控CRK/DOCK180/Rac、MEK/ERK和PI3K/Akt/mTOR信号通路中相关分子表达影响Hca-P的恶性行为;4.CRKⅠ过表达促进Hca-P增殖、黏附、迁移、侵袭及生存能力;5.CRKⅠ过表达能显著促进小鼠足垫成瘤和淋巴结转移能力;6.rAdinbitor通过CRKⅠ介导的信号通路来调控Hca-P增殖、黏附、迁移和侵袭能力。