检索历史 清除

摘要长期以来，因龋病、牙周病、创伤等原因造成的牙齿缺失对人类造成较大的困扰，包括种植牙在内的各种缺失牙修复方法各有其局限，尚不能完全恢复缺牙患者的生理和心理功能。牙组织工程和牙再生医学的出现提供了一条更为适宜的思路，即重新启动牙齿发育进程，以修复牙体、牙周组织缺损，直至全牙再生。在牙组织工程中，适宜种子细胞的选择是组织工程三要素中最为重要的内容。神经嵴来源的外胚间充质干细胞(ectomesenchymal stem cells，EMSCs)和外胚层来源的上皮细胞的连续相互作用贯穿于牙形态发生的始终。在经典的牙发育理论中，牙齿的发生是由这两个胚层细胞经复杂的上皮-间充质相互作用，并伴随着按严格时-空顺序表达的信号分子“瀑布”调控完成的。在胚胎发育早期，神经嵴细胞从中、后脑的神经嵴经上皮-间充质转化、脱层后迁移至第一腮弓，并组成第一腮弓的大部分组织，此时称为外胚间充质干细胞。牙板形成后，牙齿发育开始启动，牙板上皮来源的信号分子传递至其下方神经嵴来源的EMSCs，引起其增殖、凝聚，经牙板期、蕾状期、帽状期和钟状期等明确的牙齿发育阶段，在釉质形成后，牙根发育启动并最终萌出至咬合平面，完成牙齿的发育。在这一过程中，神经嵴来源的EMSCs形成了除牙冠釉质外全部牙体组织结构，包括其派生的牙乳头间充质细胞，其最终分化为成牙本质细胞并分泌基质，形成牙髓-牙本质复合体、以及其派生的牙囊祖细胞(dental follicle progenitor cells，DFPCs)最终形成的牙骨质、牙周膜和部分根周牙槽骨等。由此可见，牙齿发育早期的EMSCs具有双向分化特性，即向成牙本质细胞和牙囊祖细胞及其子代细胞分化的特性，理论上EMSCs作为牙组织工程的种子细胞，具有形成除釉质外牙齿全部结构的能力。但这一胚胎发育过渡性的干细胞在体外诱导环境下，是否具有牙向分化能力，尚待进一步明确。再者，目前牙发育相关研究表明，尚有非神经嵴来源的间充质参与牙形态发生，牙组织工程相关研究也提示，除了神经嵴来源的牙齿间充质干细胞，非神经嵴来源的间充质干细胞，如骨髓间充质干细胞等也可表达牙向分化能力。神经嵴源性和非神经嵴源性的间充质干细胞作为牙组织工程的种子细胞，哪一个更为适宜，尚无明确定论。因此，目前有三个亟待解决的问题:①神经嵴来源的EMSCs在体外牙向诱导环境下是否具有牙向分化能力？②神经嵴来源的EMSCs作为种子细胞，和非神经嵴来源的间充质干细胞比较，其成牙潜能如何？③牙胚的发生是通过口腔上皮与颅颌神经嵴来源EMSCs细胞间的信号分子网络调控、进而推动的复杂发育过程，而胚胎发育早期EMSCs参与牙齿发育的内在分子调控机制尚待进一步明确。因此，研究牙发育早期EMSCs的成牙潜能和内在分子机制，可以为完善牙发育学理论，以及为牙组织工程的种子细胞选择和构建组织工程牙胚，提供初步的依据和策略。<br>　　主要研究内容和结果<br>　　目的:<br>　　本课题主要对比研究大鼠胚胎11.5d(E11.5d)第一腮弓神经嵴来源的EMSCs和非神经嵴来源的EMSCs，在体外、体内成牙诱导微环境下的成牙潜能差异;利用细胞凝聚技术还原牙齿器官发育模式，从上皮-间充质相互作用和牙发育角度探讨明确的神经嵴来源的EMSCs在体外、体内的牙向分化模式;进一步以基因芯片技术探讨神经嵴来源的EMSCs在牙向分化过程中可能存在的分子机制，为牙发育机制和牙组织工程再生提供可能的理论依据和策略。<br>　　方法:<br>　　1.为明确P75-NTR标记的EMSCs在牙发育中的时空变化，我们通过对E11.5-E18.5d大鼠胚胎牙齿不同发育阶段的连续观察，利用HE和IHC技术对比观察神经嵴细胞的标记物，P75神经营养因子受体(P75-neurotrophin receptor，P75-NTR)以及胚胎干细胞标记物OCT4和SOX2，在牙发育各个时期EMSCs中的时空表达和生物学功能;<br>　　2.为获取明确的神经嵴来源的EMSCs，我们以流式细胞技术分选E11.5d大鼠胚胎第一腮弓来源的P75-NTR阳性EMSCs(P75+EMSCs)，原代细胞培养后进行增殖能力检测和干细胞鉴定;<br>　　3.为明确P75+EMSCs是否具有牙向分化能力，及探讨与非神经嵴来源的P75-NTR阴性EMSCs(P75-EMSCs)的牙向分化能力差异，我们利用大鼠切牙颈环上皮干细胞系HAT-7条件培养液和切牙颈环上皮干细胞，通过体外、体内诱导模式对P75+EMSCs进行牙向分化诱导。体外诱导模式下以HAT-7条件培养液诱导0、4、8、12d后观察细胞形态变化，透射电镜(TEM)检测诱导前后的细胞超微结构变化，流式细胞术检测细胞周期变化;对比P75-EMSCs，Western blot和Real-time PCR检测成牙关键基因和蛋白DSP、DMP1等变化;体内诱导模式下，以原代大鼠切牙颈环上皮干细胞重组P75+EMSCs/P75-EMSCs（细胞比例2∶3），以Ⅰ型胶原蛋白为重组体支架，待细胞自发凝聚后，大鼠肾被膜下移植，4周后取材进行IHC鉴定成牙关键蛋白DSP和DMP1表达;<br>　　4.为进一步探讨神经嵴和非神经嵴来源的EMSCs牙向分化差异的分子机制，我们以基因芯片微阵列分析E11.5d P75+EMSCs和P75-EMSCs基因表达谱差异基因，KEGG代谢通路分析牙发育相关信号通路。然后以siRNA-Smad4沉默P75+EMSCs的TGF-β信号通路关键蛋白Smad4，Smad4激活剂kartogenin激活P75-EMSCs的Smad4表达，以上两组细胞在HAT-7条件培养液牙向分化诱导后，以Western blot检测TGF-β信号通路关键蛋白Smad4对P75+EMSCs和P75-EMSCs牙向分化能力的影响。<br>　　结果:<br>　　1.P75-NTR作为公认的神经嵴细胞的标记物，在牙齿各个发育时期的牙源性间充质中都连续表达，可以作为神经嵴来源的EMSCs的连续标记物。其同时在牙上皮表达，显示其参与了上皮和间充质的相互作用;胚胎干细胞的标记物OCT4和SOX2的表达在牙发育早期表达较弱，在牙发育后期（钟状期）的上皮-间充质界面强烈表达，显示其协同P75-NTR调控上皮-间充质相互作用;<br>　　2.分选前EMSCs形态具有高度异质性，显示不同族群的细胞杂居生长。分选后的P75+EMSCs呈短梭三角形，形态趋于一致。P75+EMSCs分选比率为24.5％提示其在第一腮弓组织中有较高的比率。细胞增殖实验显示P75+EMSCs的增殖能力显著高于P75EMSCs。免疫荧光鉴定P75+EMSCs具备间充质干细胞表面抗原(Stro-1、vimintin)和神经嵴细胞（P75-NTR，Ap2α，HNK-1）双重标记物，同时胚胎源性标记物OCT4阳性，提示为具有神经嵴源性和间充质干细胞双重特性的外胚间充质干细胞(EMSCs);<br>　　3.P75+EMSCs在体外成牙诱导模式下细胞形态、细胞周期、细胞增殖、细胞超微结构变化以及高表达成牙本质细胞标记物Dspp(DSP)和Dmp1，证实细胞分化为具有分泌功能的成牙本质细胞样细胞。P75+EMSCs的成牙本质细胞标记物Dspp和Dmp1的mRNA显著高于P75-EMSCs。体内在牙源性上皮干细胞的诱导下，P75+EMSCs呈一定层次围绕岛型牙源性上皮，强烈表达DSP和DMP1，而P75-EMSCs细胞未见表达。体外、体内两种成牙诱导模式下证实，P75+EMSCs的牙向分化能力显著高于P75-EMSCs;<br>　　4.对比P75-EMSCs，P75+EMSCs有128个基因上调，15个基因下调(fold change≥1.5)，KEGG代谢通路分析显示涉及多个信号通路，其中TGF-β信号通路与牙齿发育密切相关。在差异基因中，Smad4是TGF-β信号通路中的关键节点。Western blot和Real-time PCR的结果也证实P75+EMSCs的Smad4表达水平显著高于P75-EMSCs。P75+EMSCs经特异性的siRNA-Smad4沉默后，其成牙能力相应受到抑制，而P75-EMSCs经smad4激活剂激活后，其成牙能力显著增加。这一结果表明，P75+EMSCs较P75-EMSCs具有更为活跃的成牙分化潜能的机制，可能在于其通过smad4介导的TGF-β信号通路实现。<br>　　结论:<br>　　综上所述，E11.5d大鼠胚胎腮弓来源的P75+EMSCs作为明确的神经嵴来源的外胚间充质干细胞，对比非神经嵴来源的P75-EMSCs，在体外和体内两种成牙诱导模式下都显示更为活跃的牙向分化潜能。这一能力可能是通过Smad4为核心的TGF-β/Smad4信号通路介导获得的。P75+EMSCs有希望作为一种新的干细胞资源，为研究完善牙发育理论，以及牙组织工程和牙再生医学提供帮助。