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摘要目的：<br>　　叉头框(Forkhead box，FOX) K1属于FOX转录因子家族，与多种肿瘤相关。本课题组此前的研究亦显示FOXK1能够促进结直肠癌的发生发展。然而，FOXK1与胃癌的关系仍不明确。我们通过生物信息学软件分析FOXK1转录起始上游的启动子，发现上面有包括c-jun在内的多种转录因子的结合位点。c-jun是JNK通路的经典下游分子，为已被确定的癌基因。很多研究表明c-jun能够促进肿瘤细胞的增殖、迁移与侵袭，包括胃癌。本课题旨在研究FOXK1在胃癌发生发展中的作用，并明确c-jun能否在转录上调控FOXK1进而影响FOXK1对胃癌的作用，为阐明FOXK1在胃癌发生发展中的作用和机制，以及FOXK1在胃癌诊断和治疗中的潜在价值奠定理论基础。<br>　　方法：<br>　　主要材料<br>　　人胃癌细胞系AGS、SGC7901、MGC803、BGC823、MKN45、MKN28，抗人FOXK1、c-jun、E-cadherin、vimentin等抗体，双荧光素酶报告基因检测试剂盒、CHIP试剂盒、免疫组化试剂盒、western blot相关试剂、cck-8试剂盒、EdU试剂盒和transwell小室等。<br>　　主要方法<br>　　1.FOXK1促进胃癌细胞增殖及侵袭转移<br>　　1.1 FOXK1在人胃癌组织中的表达情况<br>　　收集10例新鲜胃癌及癌旁组织，利用western blot检测FOXK1在胃癌组织和相应癌旁组织中的表达情况;收集20例胃癌及其癌旁组织制成石蜡标本，利用免疫组化染色验证western blot结果。<br>　　1.2 过表达FOXK1促进胃癌细胞的增殖能力<br>　　转染pcDNA3.1-FOXK1和对照pcDNA3.1质粒到MKN28细胞，利用含有1000μg/ml G418的完全培养基筛选培养，建立单克隆稳定表达株MKN28-FOXK1。western blot验证MKN28-FOXK1中FOXK1的表达情况。利用cck-8和EdU两种方法比较MKN28-FOXK1和对照细胞株MKN28-Vector的增殖能力。<br>　　1.3 过表达FOXK1促进胃癌细胞的侵袭与转移<br>　　MKN28-FOXK1和MKN28-Vector接种至6孔板，融合度接近100％时，用移液器枪头划痕，光镜下记录划痕区相对距离，继续常规培养，每隔12h拍照记录一次，评估胃癌细胞的转移能力;将Matrigel铺至transwell小室底部制成侵袭小室，室内为用无血清培养基培养的MKN28-FOXK1或MKN28-Vector，室外为完全培养基，常规培养24小时后用0.2％结晶紫染色，显微镜下计数侵袭至小室背面的细胞数量，评价高表达FOXK1对细胞侵袭能力的影响。<br>　　2.FOXK1参与胃癌细胞的EMT<br>　　2.1 FOXK1促进胃癌细胞的EMT<br>　　光镜下观察MKN28-FOXK1和MKN28-Vector细胞的形态差异;细胞免疫荧光和western blot检测MKN28-FOXK1和MKN28-Vector细胞中的E-cadherin和Vimentin的表达情况。<br>　　2.2 FOXK1参与TGF-β1诱导的胃癌细胞EMT<br>　　western blot检测不同浓度(0、0.5、1.0、2.0ng/ml) TGF-β1处理MKN28后细胞中FOXK1、E-cadherin和vimentin的表达。用1μg/ml TGF-β1处理MKN28并在0h、24h和48h分别收集细胞蛋白，western blot检测不同时间点FOXK1、E-cadherin和vimentin的表达。转染FOXK1-siRNA和对照siRNA至MKN28细胞，24小时后加或不加TGF-β1，48小时后用western blot检测FOXK1、E-cadherin和vimentin的表达;或用transwell侵袭小室检测处理后细胞的侵袭能力。<br>　　3.FOXK1为转录因子c-jun的转录激活靶点<br>　　3.1 c-jun能与FOXK1的启动子区域结合并启动下游转录<br>　　根据FOXK1启动子(600bp)内c-jun的三个潜在结合位点设计三对引物，扩增出FOXK1转录起始位点上游的三段启动子序列，分别插入到pGL3-Basic载体，构建出三个含不同结合部位的pGL3-FOXK1promoter（记为FOXK1p1，FOXK1p2和FOXK1p3）。将上述FOXK1p和c-jun表达质粒或对照质粒共转染至MKN28中，进行双荧光素酶检测并比较各组荧光素酶活性差异。另外利用染色质免疫共沉淀(ChIP)的方法，再次明确c-jun与FOXK1启动子结合及其大致结合位点。<br>　　3.2 c-jun能与FOXK1启动子区域结合<br>　　设计突变引物，以FOXK1p为模板进行扩增得到c-jun结合位点突变的产物，纯化并酶切突变产物，再将其与酶切后的pGL3相连，然后转化入感受态细胞扩增，将突变质粒测序以确定突变成功并将其命名为FOXK1-mut。双荧光素酶检测并比较野生型和突变型的荧光素酶活性以明确c-jun结合的具体位置。再将不同量(0，0.3，0.5，0.8，1.0μg)的c-jun表达质粒和FOXK1p共转染至MKN28中，以明确FOXK1启动子被激活的程度是否随c-jun表达水平的递增而上升。<br>　　结果：<br>　　1.FOXK1促进胃癌细胞增殖及侵袭转移<br>　　1.1 FOXK1在人胃癌组织中的表达情况<br>　　FOXK1在细胞中定位于胞核，且癌旁正常组织呈现无表达或者低表达而胃癌组织高表达。<br>　　1.2 过表达FOXK1促进胃癌细胞的增殖能力<br>　　FOXK1表达上调后，胃癌细胞的OD450处的吸光值明显增加;EdU显示处于DNA合成期的细胞数量上升。<br>　　1.3 过表达FOXK1促进胃癌细胞的侵袭与转移<br>　　FOXK1能促进胃癌细胞的划痕愈合能力;过表达FOXK1后穿过transwell小室的细胞数量明显增多。<br>　　2.FOXK1参与胃癌细胞的EMT<br>　　2.1 FOXK1促进胃癌细胞的EMT<br>　　过表达FOXK1后胃癌细胞从上皮细胞形态向间质细胞形态转变;上皮细胞标志E-cadherin表达下调，间质细胞标志Vimentin表达则上升。<br>　　2.2 FOXK1参与TGF-β1诱导的胃癌细胞EMT<br>　　胃癌细胞内FOXK1的表达对TGF-β1存在剂量依赖性和时间依赖性，TGF-β1在诱导胃癌细胞EMT的同时导致FOXK1表达增高;FOXK1-siRNA阻断了TGF-β1引起的EMT并抑制了胃癌细胞的侵袭能力。<br>　　3.FOXK1为转录因子c-jun的转录激活靶点<br>　　3.1 c-jun能与FOXK1的启动子区域结合并启动下游转录<br>　　生物信息学分析发现:在FOXK1启动子600bp内存在3个潜在的c-jun结合位点;双荧光素酶实验和ChIP证明c-jun能与FOXK1启动子上结合位点结合，位置可能在-362-355或-386-379。<br>　　3.2 c-jun能与FOXK1启动子区域-362-355结合<br>　　通过对结合位点进行点突变并比较野生型与突变型的荧光素酶活性，证明c-jun与FOXK1启动子结合的具体位置在-362-355;而且随着c-jun表达水平的上升，FOXK1启动子被激活的程度亦增强。<br>　　结论：<br>　　1.FOXK1在胃癌组织中高表达并能促进胃癌细胞的增殖及侵袭转移活性;FOXK1参与TGFβ诱导的EMT;<br>　　2.双荧光素酶、CHIP实验、结合位点突变均证实FOXK1启动子区域-362-355处存在c-jun结合位点;c-jun能够与FOXK1的启动子结合并激活下游基因活性;<br>　　3.FOXK1和c-jun均在胃癌组织细胞中呈现高表达且两者的表达呈正相关;FOXK1和c-jun的表达与胃癌患者预后相关;FOXK1能够作为判断胃癌预后的独立危险因素;<br>　　4.C-jun作为FOXK1的上游调控分子，降低c-jun表达能抑制FOXK1诱导的EMT和胃癌细胞增殖、侵袭转移能力;<br>　　5.体内实验再次验证c-jun参与调节FOXK1诱导的胃癌细胞EMT和侵袭转移。<br>　　以上结果均提示c-jun在一定程度上参与了FOXK1的转录调控并影响FOXK1在胃癌发生发展中的作用;c-jun为癌基因，FOXK1为促进胃癌的侵袭转移的转录因子，c-jun/FOXK1在胃癌EMT及侵袭转移中具有重要作用。