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摘要目的:一、合成GPC3受体靶向多肽L5并验证该多肽与肝细胞癌细胞的结合能力，为进一步探针制备和肝细胞癌靶向性显像研究奠定基础。<br>　　二、用5-羧基荧光素（5-carboxyfluorescein，FAM）标记L5多肽，制备荧光探针（FAM-L5），并用荧光显像方法研究该荧光探针的靶向性。<br>　　三、用正电子核素18F标记靶向多肽L5制备PET分子探针(18F-L5)，通过micro-PET/CT显像，研究该探针用于肝细胞癌显像的可行性。<br>　　方法: 一、靶向GPC3受体多肽L5及其荧光多肽FAM-L5的合成<br>　　1.GPC3靶向多肽L5的化学合成。<br>　　2.荧光标记靶向肽FAM-L5的合成。<br>　　3.NOTA修饰多肽L5由中肽公司合成。<br>　　二、荧光多肽FAM-L5的体外结合试验<br>　　1.免疫荧光检测肝细胞癌HepG2细胞及正常肝细胞HL-7702细胞GPC3的表达<br>　　2.体外肝细胞癌细胞株HepG2同荧光多肽FAM-L5的结合及竞争抑制试验<br>　　三、荧光多肽FAM-L5的体内试验<br>　　1.裸鼠肿瘤模型的建立及确定<br>　　2.FAM-L5在肿瘤组织及正常组织脏器内的摄取及分布研究<br>　　3.FAM-L5在荷肝细胞癌肿瘤模型体内的荧光生物学分布研究<br>　　4.荧光显像分析<br>　　四、PET分子探针18F-L5的合成和micro PET/CT显像研究<br>　　1.PET分子探针的合成<br>　　2.Micro PET/CT显像<br>　　结果：一、靶向GPC3受体多肽及其荧光多肽FAM-L5的合成<br>　　1.GPC3靶向肽L5的合成。经HPLC纯化、分析结果显示L5纯度为99.15％。<br>　　2.FAM标记荧光多肽FAM-L5的合成。经HPLC纯化、分析结果显示，FAM-L5的纯度为98.44％。<br>　　3.NOTA修饰L5的合成。经HPLC纯化、分析结果显示，NOTA-L5的纯度为95.4％。<br>　　4.验证肝细胞癌HepG2细胞和人正常肝细胞HL-7702细胞表达GPC3受体的实验:经过细胞免疫荧光试验，共聚焦显像显示肝细胞癌HepG2细胞高表达GPC3受体，而人正常肝细胞HL-7702细胞低表达GPC3受体。<br>　　5.荧光多肽FAM-L5与细胞的结合实验<br>　　二、荧光多肽FAM-L5的体内试验<br>　　1.裸鼠肿瘤模型的建立<br>　　4周龄无胸腺裸鼠皮下接种HepG2细胞，饲养14天左右可见肿瘤结节，待4至6周肿瘤增大至1.0cm左右用于试验。共接种6批，每批5只，共30只，其中25只成瘤，5只无肿瘤生长，成瘤率为83.3％。将其中1个肿瘤切下来进行病理组织学检测，病理结果显示符合肝细胞癌改变。<br>　　相同条件的无胸腺裸鼠皮下接种U87MG细胞，饲养14天左右可见肿瘤结节，待4-6周肿瘤增大至1.0cm进行试验。共接种3批，每批5只，共15只，其中12只成瘤，3只无肿瘤生长，成瘤率为80％。其中1只肿瘤切下来进行病理组织学检测，病理结果显示符合脑胶质瘤改变。<br>　　2.荧光多肽FAM-L5在肿瘤组织中的摄取及分布研究<br>　　经荷肝细胞癌裸鼠尾静脉注射FAM-L5（1mM，150μL）1小时后，分离肿瘤组织，制作切片观察荧光标记多肽在肿瘤内的分布情况，结果显示肿瘤组织内可见明显荧光聚集。分离正常肝组织制作切片，观察到正常肝组织内有荧光分布但荧光强度明显低于肿瘤组织。<br>　　三、肝细胞癌FAM-L5荧光受体显像研究<br>　　研究结果显示注射FAM-L51小时后，肝细胞癌HepG2肿瘤组织内呈现FAM-L5明显高摄取，而正常的肝脏组织仅见荧光轻微摄取，相对荧光强度肿瘤/肝脏比值为14.28±7.90。从体内分布看，该荧光多肽主要通过胆囊-肠道途径排泄，注射1小时后，大部分荧光分布于胆囊及肠道内。脑、双肺、心脏、脾脏、双肾及肌肉组织内荧光分布均很低，提示非特异性摄取低。<br>　　对照肿瘤人脑胶质瘤U87MG，静脉注射FAM-L51小时后，U87 MG肿瘤部分荧光摄取较低，仅略高于正常肝脏组织，其肿瘤/正常肝脏比值为1.44±0.53。两种肿瘤摄取FAM-L5的相对荧光强度比较，肝细胞癌HepG2肿瘤摄取FAM-L5的相对荧光强度明显高于脑胶质瘤U87MG(14.28±7.90 vs1.44±0.53, t=3.69,P=0.008)。<br>　　四、PET分子探针18F-L5的研制及PET/CT显像研究<br>　　1.18F-NFP-L5和18F-AlF-NOTA-L5的放化标记<br>　　18F-NFP-L5的放化标记:以18F-NFP为前体顺利合成了18F-NFP-L5，实现了靶向多肽L5的放射性标记。总标记时间为180-200min，标记产物率约为10％，经HPLC测定合成产物的纯度为98.45％。<br>　　18F-Al18F-NOTA-L5的放化标记:以NOTA-L5为反应前体，采用Al18F螯合反应，实现18F标记NOTA-L5。总标记时间为60min，标记率为50％-69.8％。<br>　　2.荷瘤裸鼠micro PET/CT显像研究<br>　　结论：1.本研究成功合成了靶向GPC3受体的多肽L5，合成纯度为99.15％，可满足研究需要。<br>　　2.成功用FAM标记L5，成功制备荧光探针FAM-L5，纯度为98.44％，可满足体内及体外反应的需求。<br>　　3.体外荧光探针FAM-L5与细胞的结合试验表明FAM-L5能被高表达GPC3受体的细胞HepG2大量摄取，其摄取符合受体-配体竞争结合规律。<br>　　4.肿瘤组织荧光显像研究表明:荧光多肽FAM-L5能在肝细胞癌肿瘤组织中大量聚集。<br>　　5.正常裸鼠体内FAM-L5的荧光生物学分布研究显示FAM-L5主要经胆肠系统排泄。<br>　　6.成功合成了PET探针18F-NFP-L5和18F-NOTA-L5，其中18F-NOTA-L5标记率为14.6％-69.8％，标记率较高，可以进行大量动物试验。<br>　　7.经micro PET/CT显像研究显示，18F-NFP-L5和18F-NOTA-L5能靶向肝细胞癌肿瘤组织。<br>　　8.FAM-L5、18F-NFP-L5及18F-NOTA-L5都能靶向高表达GPC3受体的肝细胞癌肿瘤组织，可以作为靶向GPC3受体的荧光探针及PET探针。