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摘要目的：本研究采用原代骨髓来源的巨噬细胞和THP1，分别抑制或过表达mig6基因与EGFR的磷酸化水平，研究对相互的影响，以及对下游炎症因子TNF-α的作用。具体研究问题为:<br>　　1.mig6是否对EGFR的磷酸化具有负反馈调节的作用;<br>　　2.mig6与EGFR的相互作用是怎样的，是否也对下游的TNF-α的产生有影响。<br>　　方法：1.实验分组:<br>　　1)将培养后的THP1细胞或者BMM细胞根据LPS作用时间处理时分为5个组:control组，15min组，30min组，1h组，2h组。<br>　　2)将培养后的THP1细胞或者BMM细胞给予抑制剂预处理时分为4个组:对照组，厄洛替尼(erlotinib)组（20μM），LPS组（500μg/L），LPS+ erlotinib组，使用抑制剂预处理30min后再使用LPS刺激1h。<br>　　3)根据转染mig6-siRNA或过表达mig6病毒分组:NC组（阴性对照），NC+LPS组，siRNA/LV-mig6组，siRNA/Lv-mig6+LPS组。siRNA或Lv-mig6转染24-48h后LPS刺激。<br>　　2.siRNA/LV-mig6转染沉默mig6基因:为了了解mig6的表达水平不同对EGFR磷酸化水平和分泌的TNF-α的影响，对THP1和巨噬细胞转染siRNA和过表达mig6的病毒，24-48h完全换液终止转染后，LPS刺激。siRNA转染分组如下:NC组和siRNA组，检测对mig6基因沉默的效果。<br>　　3.酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)检测细胞上清TNF-α的表达:LPS刺激细胞4h，收集上清，使用检测TNF-α表达水平。<br>　　4.PCR法检测细胞中mig6的mRNA表达:细胞提取总RNA反转录后，通过实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase Chain Reaction，Q-PCR)检测mig6 mRNA的表达情况。<br>　　5.western-blot检测各组细胞磷酸化蛋白EGFR表达:给药4h后，收集细胞并使用磷酸盐缓冲液清洗2遍，使用western-blot法检测细胞磷酸化蛋白EGFR和mig6的表达。<br>　　6.统计学分析:采用SPSS19.0统计学软件进行统计分析，计量资料均数±标准差((x)±s)表示。不同时间点采用重复测量;两组比较采用两独立样本t检验;多组比较采用单因素方差分析(one way ANVOA)，组间比较有显著差异时，方差齐用LSD检验，方差不齐用Dunnett'sT3检验。α=0.05为检验水准。作图使用GraphPad Prism5.0作图软件。<br>　　结果:1.LPS不同作用时间对mig6表达的影响:<br>　　在原代巨噬细胞中，LPS（预实验测得浓度为500μg/L）作用1h时与其他作用时间的相比，mig6的mRNA表达升高明显（P＜0.05），根据结果我们选取mig6 mRNA受到LPS刺激作用的时间为1h。<br>　　2.EGFR的抑制剂对LPS诱导的mig6表达的影响:<br>　　原代巨噬细胞中，给予Elotinib（20μmol/L）预处理30min，分组给予LPS刺激1h，收集细胞进行PCR检测mig6 mRNA表达，发现与LPS组相比，LPS+erlotinib组mig6基因表达明显降低（(*)P＜0.05）差异有统计学意义，LPS刺激4h，收集细胞进行蛋白提取，用western-blot法检测mig6蛋白表达，发现与LPS组相比，LPS+ erlotinib组mig6蛋白表达明显降低（(*)P＜0.05）差异有统计学意义。<br>　　3.siRNA-mig6对LPS诱导的EGFR磷酸化水平和TNF-α的影响:<br>　　原代巨噬细胞和THP1中，转染siRNA沉默mig6的基因表达，24-48h后进行终止，收集细胞进行蛋白提取，应用westen-blot检测mig6的蛋白表达是否被沉默，与阴性对照NC组相比，mig6的蛋白表达显著降低（(*)P＜0.05）。LPS作用巨噬细胞30min收集细胞提取蛋白进行western-blot检测，与NC+LPS组相比，siRNA+LPS组EGFR的磷酸化水平明显升高（(*)P＜0.05）;LPS作用4h后收集细胞上清液用ELISA检测TNF-α水平，发现与NC+LPS组相比，siRNA+LPS组EGFR的磷酸化水平明显升高（(*)P＜0.05）。<br>　　4.过表达mig6病毒对LPS诱导的TNF-α的影响:<br>　　原代巨噬细胞转染mig6过表达的病毒，用PCR方法检测mig6的表达。与阴性对照NC-mig6组比较，Lv-mig6组mig6基因表达量增高。将各组细胞LPS作用4h后收集上清液用ELISA检测分泌出胞外TNF-α的水平，与NC+LPS组相比，Lv-mig6+LPS组，TNF-α的表达量下降（*P＜0.05）。western-blot检测EGFR磷酸化水平，与NC+LPS组相比，Lv-mig6+LPS组EGFR的磷酸化水平明显降低（*P＜0.05）。<br>　　结论：1.在巨噬细胞中，mig6会受到不同LPS作用时间表达水平不同。<br>　　2.在巨噬细胞中，抑制EGFR的磷酸化水平可以抑制mig6基因表达。<br>　　3.在巨噬细胞中，mig6作为EGFR的负反馈调节抑制其磷酸化水平。<br>　　4.mig6通过调节EGFR的磷酸化水平，抑制下游TNF-α的分泌。