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摘要原发性肝癌，是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，发病率逐年上升，是世界上肿瘤致死的第三大原因。[1]原发性肝癌发生的主要原因有:酗酒，乙肝或丙肝病毒的慢性感染，肝硬化等。尽管对肝癌病因的研究已经有了长足的进步，但遗传因素和肝癌发生的具体关系仍未可知[2]。总的来说，肿瘤的发生和癌基因的激活和抑癌基因的失活有关[3]。因此，理清肝癌发生发展过程中基因表达失调的原因，将有利于阐明肝癌发生发展机制，从而为临床治疗肝癌提供新的方向。<br>　　UBE2V1，又名CROC1，位于染色体20q13.2，在体内至少表达4中不同的剪接体。已有研究表明，在HT-29-M6细胞中持续高表达UBE2V1可抑制细胞的分化，并且可通过抑制细胞周期有丝分裂激酶CDK1的表达调节细胞周期[4]。UBE2V1可通过介导原癌基因c-fos的转录激活而参与到调节细胞不同生理功能的细胞内信号通路[5]。高表达UBE2V1有利于促进细胞的永生化，并且，在一些肿瘤起源的细胞中，UBE2V1也是高表达的[6]。有学者研究发现，UBE2V1在几乎所有的肿瘤细胞中均高表达，而UBE2V2仅在一部分肿瘤细胞中高表达，二者均可能参与到细胞分化和肿瘤发生过程中[7]。UBE2V1和UBE2V2属于E2酶家族一员，但独立存在时均缺乏E2酶活性所需的半胱氨酸残基，UBE2V1与另一E2酶家族成员UBC13结合，形成的UBE2V1/UBC13复合物发挥E2酶活性，可与TRAF6（一种E3酶）相互作用，催化形成以泛素分子63位赖氨酸残基相连的多泛素链，进而激活IKK，IKK激活后促进NF-kappaB通路的激活[8]。<br>　　最近的研究表明，一种可以抑制Ubc13/UBE2V1形成的复合物NSC697923，可以通过抑制ABC-DLBCL细胞中NF-kappaB通路的激活来抑制ABC-DLBCL和GCB-DLBCL细胞的增殖和存活，同样可抑制原代弥漫大B细胞淋巴瘤细胞的存活[9]。研究发现，在MDA-MB-231细胞中，同正常乳腺细胞相比，UBE2V1基因的表达量升高，在MDA-MB-231细胞中过表达UBE2V1足以激活NF-kappaB通路，进而促进MMP1的表达，促进乳腺癌细胞的表达。更重要的是，干扰UBE2V1的表达，可以抑制MMP1的表达，进而抑制乳腺癌细胞在裸鼠体内的成瘤和转移能力[10]。<br>　　UBE2V2，又称hMMS2，在酵母中的同源基因为MMS2，MMS2可以保护酵母细胞免受一系列DNA损伤因素的伤害，干扰MMS2基因的表达不仅可以导致MMS和紫外线对酵母的杀伤能力，又可导致自发突变的急剧增加。遗传分析表明，MMS2通过RAD6途径来进行DNA的无错修复[11]。<br>　　研究表明，UBC13可以和MMS2形成异源二聚体，来行使泛素交联酶活性，UBC13-MMS2可促进非经典的多泛素链的形成，这一泛素链是通过泛素分子63位赖氨酸连接起来的。RING型E3酶，包括DNA结合蛋白RAD18与RAD5，可以与RAD6和UBC13-MMS2相互作用，使之被招募至染色质位置，来进行DNA损伤后的修复[12]。<br>　　最近研究表明，在ER+/HER-的乳腺癌患者中，UBE2V2基因的表达量高低与病人的预后密切相关，UBE2V2基因的表达量越高，预后越差[13]。<br>　　既有研究表明，UBE2V1和UBE2V2可以参与到多种细胞进程，包括NF-kappaB通路的激活和DNA损伤后的修复，这些生命过程涉及到细胞的生长分化，调节细胞周期，克服细胞衰老等，均与肿瘤的发生发展密切相关，但是，到目前为止，二者在肝癌中的研究还处于一片空白。<br>　　因此，本研究以肝癌细胞为研究对象，采用分子克隆技术，蛋白质免疫印迹，裸鼠皮下成瘤，小动物活体成像、免疫组织化学等现代实验方法，对UBE2V1和UBE2V2肝癌中的发生发展中的作用进行研究。<br>　　目的:<br>　　1.检测UBE2V1和UBE2V2在正常肝细胞和肝癌细胞中的表达量。<br>　　2.构建高表达UBE2V1和UBE2V2的肝癌稳定细胞株。<br>　　3.探索UBE2V1和UBE2V2在肝癌细胞体内外生长转移方面具有的生物学作用。<br>　　4.研究UBE2V1和UBE2V2影响肝癌细胞生长和转移的机制。<br>　　方法:<br>　　1.提取细胞的RNA，逆转录为cDNA后作为模板，在特异性的上下游引物作用下，用PCR法获得目的基因。经PCR和双酶切后，连接到慢病毒表达载体LV5中，得到重组质粒LV5-UBE2V1和LV5-UBE2V2，测序正确后委托公司包装得到重组慢病毒颗粒。重组病毒感染肝癌细胞。感染后的细胞采用嘌呤霉素筛选1周，Western Blot验证表达后进行扩大培养、冻存，用于后续实验。<br>　　2.将稳定表达UBE2V1和UBE2V2肝癌细胞株及其对照细胞株以相等的数量接种于24孔板，每隔24h用CCK8法检测不同组的肝癌细胞的增殖状况并绘制生长曲线;<br>　　3.将稳定表达UBE2V1和UBE2V2肝癌细胞株及其对照细胞株以相等的数量接种于6孔板，经过约半个月的常规培养后，用平板克隆形成实验检测细胞的体外克隆形成能力;<br>　　4.将稳定表达UBE2V1和UBE2V2肝癌细胞株及其对照细胞株以相等的数量接种于6孔板，过夜后用枪头在铺满孔板的细胞中划出一道相同宽度的划痕，用培养基冲洗后换为无血清培养基，在相同时间内测量实验组和对照组细胞爬过划痕的距离并比较，以此测量细胞的迁移能力。<br>　　5.在Transwell上室接种相同数量稳定表达UBE2V1和UBE2V2肝癌细胞株及其对照细胞株，在相同的时间内，检测细胞穿过膜的数量，通过Transwell实验检查重组细胞的迁移能力。<br>　　6.在Transwell上室铺一层基质胶，然后在Transwell上室接种相同数量稳定表达UBE2V1和UBE2V2肝癌细胞株及其对照细胞株，在相同的时间内，检测细胞穿过膜的数量，以此检测重组细胞的侵袭能力。<br>　　7.在裸鼠前肢两侧腋下皮下接种相等数量的稳定表达UBE2V1和UBE2V2肝癌细胞株及其对照细胞株，观察记录两组细胞瘤体的生长情况并绘制生长曲线，并用免疫组织化学的方法分析两组瘤体中ki67和actived-Caspase3的表达。<br>　　8.通过尾静脉向裸鼠体内注射相同数量的重组肝癌细胞和对照组细胞株，构建肝癌转移模型，同时用小动物活体成像实验检测UBE2V1和UBE2V2对肝癌细胞在体内转移的影响。<br>　　9.用蛋白免疫印记检测重组稳定肝癌细胞株中p-AKT和p-ERK的表达量，以检测UBE2V1和UBE2V2在体外促进肝癌细胞转移的机制。<br>　　10.用免疫组织化学法检测重组稳定肝癌细胞株形成的瘤体中c-myc、UBE2V1、UBE2V2、caspase3、ki67、p-AKT和p-ERK的表达量，以检测UBE2V1和UBE2V2在体内瘤体中的表达及促进肝癌细胞生长和转移的机制。<br>　　结果:<br>　　1.成功构建了高效表达UBE2V1和UBE2V2的慢病毒载体，包装成慢病毒颗粒后感染肝癌细胞系SMMC-7721、QSG-7701和Hep3B细胞。经嘌呤霉素进行压力筛选后， Western Blot检测结果表明感染细胞中UBE2V1和UBE2V2的表达量明显增高，提示成功构建稳定表达UBE2V1和UBE2V2的肝癌细胞。<br>　　2.采用CCK8法检测稳定高表达UBE2V1和UBE2V2的SMMC-7721、QSG-7701和Hep3B细胞和相应对照细胞的增殖情况，结果显示高表达UBE2V1和UBE2V2对细胞体外增殖无显著影响(P＞0.05)，结果无统计学意义。<br>　　3.克隆形成实验显示高表达UBE2V1和UBE2V2的稳定细胞株，其克隆形成能力和对照组，亦无明显改变(P＞0.05)，结果无统计学意义。<br>　　4.细胞划痕实验结果显示，稳定高表达UBE2V1和UBE2V2的肝癌细胞株在相同时间内爬过划痕的距离远远大于对照组细胞株(P＜0.05)，提示:稳定高表达UBE2V1和UBE2V2能在体外明显促进肝癌细胞的迁移。<br>　　5.Transwell迁移实验结果显示，稳定高表达UBE2V1和UBE2V2的肝癌细胞株在相同时间内穿过transwell膜的细胞数远远大于对照组细胞株(P＜0.05)，提示:稳定高表达UBE2V1和UBE2V2能在体外明显促进肝癌细胞的迁移。<br>　　6.Transwell侵袭实验结果显示，在存在基质胶的情况下，稳定高表达UBE2V1和UBE2V2的肝癌细胞株在相同时间内穿过transwell膜的细胞数远远大于对照组细胞株(P＜0.05)，提示:稳定高表达UBE2V1和UBE2V2能在体外明显促进肝癌细胞的侵袭。<br>　　结论:<br>　　UBE2V1和UBE2V2对体外肝癌细胞的增殖能力和克隆形成能力并无影响;但可促进肝癌细胞在体外的转移和侵袭能力;体内实验表明，UBE2V1和UBE2V2可促进肝癌细胞在裸鼠体内的生长和转移。对于UBE2V1来说，这一结果可能是通过激活PI3K/Akt/mTOR通路信号通路实现的，而对于UBE2V2来说，这一过程可能通过激活PI3K/Akt/mTOR和MAPK信号通路实现的。