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摘要目的：<br>　　1.基于高通量测序数据库，筛选与细胞分化和轴突导向相关的microRNAs;<br>　　2.基于生物信息学方法和实验手段，明确miR-16，miR-30c与sema3A的靶向关系;<br>　　3.探讨miR-30c/sema3A对体内成年室下区新生神经元的影响;<br>　　4.揭示miR-30c/sema3A影响成年室下区新生神经元的机制;<br>　　5.检测miR-30c对嗅球新生神经元的影响;<br>　　6.探讨miR-30c/sema3A在调控成年神经再生信号通路上的下游介导分子和机制;<br>　　7.检测miR-30c/sema3A引起的成年神经再生能力的改变对嗅觉和记忆的影响。<br>　　方法：<br>　　1.利用基因表达文库(Gene Expression Omnibus，GEO)高通量测序结果和系统聚类分析(Hierarchical Clustering，HCL)及自组织映射(Self-organization Mapping，SOM)表达模式分析，筛选不同发育时期间的差异表达microRNAs;<br>　　2.构建microRNAs上调和下调载体及双荧光素酶报告系统检测载体，合成microRNAs mimics等，通过双荧光素酶报告系统及qRT-PCR检测microRNAs和sema3A的表达量，确定microRNAs与sema3A基因之间的靶向关系;<br>　　3.构建microRNA上调和下调慢病毒载体，进行慢病毒包装，通过脑立体注射技术分别将microRNA上调和下调慢病毒注射到室管下区以检测microRNA对成年室下区新生神经元数量的影响，并通过流式分选(FACS)和qRT-PCR定量技术，检测microRNA和sema3A在此过程中对应表达量的变化;<br>　　4.对成体室下区脑片和microRNA上调及下调处理的室下区原代神经元的形态进行分析，并利用实时细胞检测系统(RTCA)和流式细胞仪分别对细胞增殖和细胞周期进行检测;<br>　　5.利用BrdU对新生神经元进行追踪;通过脑立体注射技术将miR-30c上调和下调慢病毒分别注射到室管下区，之后对脑片的干细胞及分化细胞进行特异性免疫荧光显色，以检测miR-30c对室下区微区和嗅球内不同种系神经元的影响;利用TUNEL试剂盒对室下区凋亡情况进行检测;<br>　　6.设计GSK3β和c-myc siRNA，利用上述siRNA分别对神经母瘤细胞Neuro2A进行处理，随后对细胞的形态和增殖(RTCA)情况进行检测，并利用蛋白免疫印迹对上述处理后的蛋白水平进行检测，以确定分子之间的相互关系;<br>　　7.对miR-30c过表达和下调后所引起的嗅球整体结构的变化进行检测，利用食物掩埋方法，检测miR-30c表达水平变化后对嗅觉行为的影响;并利用脑立体注射技术、BrdU新生神经元追踪技术、条件恐惧记忆和水迷宫行为学实验检测齿状回内miR-30c表达水平变化对海马新生神经元的影响及对海马的条件记忆和空间记忆的影响。<br>　　结果：<br>　　1、筛选出能同时参与细胞增殖和轴突导向microRNAs<br>　　我们基于GEO数据库，对不同发育时期室下区高通量ncRNA测序数据进行提取，随后对其进行方差分析，发现差异表达microRNA占8％(74个)，对这些microRNAs进行聚类分析和SOM表达模式分析后，发现差异表达microRNAs的表达模式有两种(逐渐增加型:63个microRNAs;逐渐下降型:11个microRNAs)。其中miR-16和miR-30c是差异表达最为显著的2个microRNAs，均属于表达模式降低型microRNAs。随后的生物信息学分析显示， sema3A可以通过同时参与两信号通路的miR-16和miR-30c而与细胞分化途径相联系。<br>　　2、miR-30c是sema3A特异的调控因子<br>　　通过双荧光素酶报告系统，我们发现miR-30c能够显著抑制sema3A的表达(55±1.2％，p＜0.05)，当sema3A与miR-30c结合位点突变后，发现miR-30c对sema3A的抑制性被解除(78±4％，p＞0.05)。而无论在sema3A的野生型报告系统还是突变型报告系统，miR-16对sema3A的表达均无影响。不同浓度的microRNAs mimics的双荧光素酶报告系统检测结果验证了上述结果的正确性。用上述载体和mimics处理Neuro2A细胞后，qRT-PCR检测microRNAs和sema3A的表达，发现miR-30的表达与sema3A呈负相关，而miR-16的表达与sema3A之间则无相关性。并且，在Neuro2A细胞中，sema3A的表达与miR-30c上调载体呈现负相关;而与miR-30c下调载体的表达趋势高度一致。上述结果证实，miR-30c是sema3A的调控因子。<br>　　3、miR-30c通过负向调控sema3A的表达增加新生神经元的数量<br>　　利用BrdU分别对脑立体注射有miR-30c上调和下调慢病毒的小鼠进行新生神经元追踪，结果发现miR-30c上调后可明显促进室下区及迁移流内新生神经元的数量(室下区:4.59±1.74倍，p＜0.01;迁移流:8.69±1.32倍，p＜0.001)，miR-30c下调后的结果与此相反。利用流式细胞仪对室下区表达miR-30c上调和下调载体的细胞进行分选，随后的qRT-PCR结果显示miR-30c上调细胞中，sema3A的表达明显降低(0.41±0.012倍，p＜0.001);miR-30c下调细胞中，sema3A的表达明显增加(2.48±0.023倍，p＜0.001)。此结果提示，miR-30c通过负向调控sema3A来影响室下区新生神经元的数量。<br>　　4、miR-30c/sema3A通过调控细胞增殖和分化途径来影响新生神经元数量<br>　　为了进一步检测miR-30c/sema3A是通过什么途径来影响室下区新生神经元的数量，我们利用miR-30c上调和下调慢病毒处理体外培养的室下区原代神经元，对其细胞形态进行检测，发现miR-30c上调后，室下区神经元分化程度明显降低，miR-30c下调后，室下区神经元分化程度得到加强。体内miR-30c上调和下调慢病毒侵染室下区脑片的细胞形态也印证了以上结果。随后，利用实时细胞检测技术(RTCA)分别对miR-30c上调和下调载体处理的Neuro2A的增殖进行检测，发现 miR-30c上调后细胞增殖明显增强，而miR-30c下调后细胞增殖明显降低。进一步的细胞周期检测结果显示，miR-30c上调后，可以明显加速细胞周期的进程。而miR-30c下调后，明显抑制细胞周期的进程。<br>　　5、GSK3β/c-myc介导了miR-30c/sema3A的细胞增殖和分化信号通路<br>　　通过对相关文献和信号通路的分析，我们锁定GSK3β/c-myc分子作为备选的miR-30c/sema3A的下游信号介导分子。通过siRNA分别干扰GSK3β和c-myc，对细胞增殖和形态进行分析，我们发现GSK3β具有促进细胞分化抑制细胞增殖的功能，而c-myc的功能与此相反;联合miR-30c上调和下调后细胞增殖和分化的结果，及对上述处理组相应蛋白表达情况的鉴定，我们得出miR-30c上调后负向调控sema3A的表达，sema3A表达降低后，抑制GSK3β的活性，从而使c-myc Thr58位点磷酸化水平降低，c-myc总量增加，从而促进细胞增殖;miR-30c下调后结果与此相反。<br>　　6、miR-30c引起的细胞增殖分化通路对嗅球和海马结构和功能的影响<br>　　miR-30c表达水平的变化可以改变细胞增殖和分化速度，引起新生神经元数量的变化。为了检测miR-30c对新生神经元迁移靶区的影响，我们分别对室下区和海马齿状回进行脑立体定位显微注射miR-30c上调和下调慢病毒。BrdU新生神经元追踪，干细胞和分化细胞特异性免疫荧光显色结果显示，miR-30c上调后，各处理组较之对照组在迁移速度上无差异。室下区、嗅球及海马齿状回处的新生神经元均增加，其中室下区神经干细胞比例增加而分化后细胞比例降低;对嗅球和海马神经元的检测结果显示，嗅球和海马干细胞和分化细胞都有一定比例增加。miR-30c下调后结果与上述相反。进一步的行为学检测结果显示，室下区miR-30c下调后，其嗅觉灵敏度明显降低(p＜0.05）;海马齿状回处miR-30c下调后，其条件恐惧记忆及空间记忆能力也均明显下降(p值范围分别为:p＜0.05;p＜0.01）。而上述对应的miR-30c上调组和对照组相比其行为学上无明显差异。以上结果表明，miR-30c水平的变化，可以影响成年新生神经元的再生，并且一定数量的成年新生神经元有利于增强嗅觉灵敏度和改善海马的条件和空间记忆能力。<br>　　结论：<br>　　基于以上研究，我们的结果首次揭示:1）miR-30c可以通过负向调控sema3A的方式参与成年神经再生过程;2）miR-30c/sema3A是通过调控成年神经干细胞的增殖和分化的方式来调控成年新生神经元的数量;3）GSK3β和c-myc很可能作为下游分子介导了miR-30c/sema3A对成年再生的调控;4)miR-30c/sema3A引起的室下区和海马齿状回处神经再生能力的改变直接影响嗅觉和学习记忆能力。