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摘要实验目的:<br>　　恶性肿瘤的发病率和死亡率一直居高不下，已成为威胁人类健康的主要病因之一。传统的抗肿瘤治疗方法因缺乏靶向性而达不到预期的效果。近年来，采用针对恶性肿瘤特异标记物的分子靶向治疗越来越受到人们的关注和认可，其中，最受关注的是将叶酸作为靶向分子，对肿瘤细胞表面的叶酸受体进行特异性靶向。本研究以石墨烯为载体，共轭结合叶酸，然后物理吸附磁纳米颗粒(Fe3O4)，形成一个既可用于靶向癌细胞输送，又可用于MRI成像的新型纳米载体系统，有望在肿瘤的靶向诊断与治疗中实现新的突破。<br>　　实验方法:<br>　　本课题采用石墨粉与聚乙烯亚胺(PEI)共混球磨的方法制备了氨基功能化石墨烯(PEI-G)，然后通过PEI-G的氨基与叶酸的羧基共价键反应形成酰胺键，制备了叶酸-石墨烯复合材料(FA-PEI-G)。最后通过分子间作用力物理吸附Fe3O4，制备了叶酸介导的FA-PEI-G/Fe3O4复合材料。采用拉曼光谱、紫外吸收光谱、傅里叶红外光谱、X射线衍射、X射线光电子能谱分析等方法对FA-PEI-G/Fe3O4进行理化性能表征。选取了人口腔表皮样癌细胞(KB)和人眼脉络膜黑色素瘤细胞(OCM-1)探讨了FA-PEI-G/Fe3O4复合材料对细胞的毒性以及靶向性。其中，本研究采用荧光定量PCR和免疫荧光法等实验检测了KB、OCM-1细胞叶酸受体的表达量;采用CCK-8、乳酸脱氢酶试剂盒(LDH)、ROS试剂盒鉴定了FA-PEI-G/Fe3O4复合材料对KB、OCM-1细胞的生物相容性;通过普鲁士蓝染色和透射电子显微镜观察的方法，确定了FA-PEI-G/Fe3O4复合材料对KB、OCM-1细胞的靶向性。<br>　　实验结果:<br>　　1.氨基功能化石墨烯(PEI-G)的表征结果<br>　　原子力显微镜(AFM)与透射电子显微镜(TEM)表征结果证明通过球磨法制备的石墨烯纳米片层厚度在1～2nm。Raman、UV、FTIR、XPS等表征表明制备的氨基功能化石墨烯同时具有石墨烯与聚乙烯亚胺的特征峰。<br>　　2.叶酸-石墨烯/Fe3O4复合材料(FA-PEI-G/Fe3O4)的表征结果<br>　　通过UV、FTIR的表征结果表明通过酰胺化反应制备的叶酸-石墨烯纳米材料同时具有叶酸和PEI-G的特征峰，XRD、TEM、磁滞曲线等表征结果证明FA-PEI-G纳米材料通过分子间作用力吸附了Fe3O4，成功制备了叶酸介导的石墨烯/Fe3O4复合材料(FA-PEI-G/Fe3O4)。<br>　　3.细胞表面叶酸表达量鉴定及细胞毒性检测结果<br>　　(1)荧光定量PCR和免疫荧光结果显示KB细胞表面叶酸受体表达量很高，而OCM-1细胞表面几乎没有叶酸受体蛋白表达。<br>　　(2)CCK-8、ROS、LDH分析实验均表明FA-PEI-G/Fe3O4复合材料对KB、OCM-1细胞展现出良好的生物相容性。其中，CCK-8的结果表明FA-PEI-G/Fe3O4复合材料在浓度为200μg/ml时，细胞的存活率依然在100％左右，跟对照组相差不大。ROS，LDH释放量相对于对照组也都比较低。<br>　　4.叶酸-石墨烯/Fe3O4复合材料(FA-PEI-G/Fe3O4)的靶向性鉴定<br>　　采用普鲁士蓝染色和透射电子显微镜(TEM)观察的方法显示部分FA-PEI-G/Fe3O4进入了KB细胞，且随着细胞培养时间的延长而增加;只有少量FA-PEI-G/Fe3O4进入了OCM-1细胞，并且不随细胞培养时间的延长而增加。透射电镜(TEM)同时显示FA-PEI-G/Fe3O4复合材料虽然进入了细胞但并没有损伤细胞，与上述细胞毒性检测的结果一致。<br>　　实验结论:<br>　　本论文采用了新型的廉价、简单、安全的边缘功能化球磨法制备了氨基功能化的石墨烯(PEI-G)，通过共价键作用将叶酸固定在PEI-G，最后通过物理吸附在纳米材料表面引入磁纳米粒子Fe3O4，用于高靶向的抗肿瘤载药体系FA-PEI-G/Fe3O4。所合成的复合材料对细胞呈现出良好的生物相容性，而且对叶酸受体高表达的KB细胞具有特异靶向性，对叶酸受体不表达的OCM-1细胞不具有靶向性。研究结果表明FA-PEI-G/Fe3O4具有作为肿瘤靶向诊断与治疗的潜在可能性。