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摘要现代社会，衰老和肥胖无疑已经成为日益严重的全球公共健康问题和临床医学领域的严峻挑战。两者紧密相关，存在很多共性，特别是引起它们的首要原因都是能量代谢失衡。越来越多的临床病例和实验研究证明，下丘脑作为能量代谢控制中心，同时也是衰老和肥胖的重要生理病理基础;下丘脑慢性炎症可能是整个机体衰老和肥胖的共同根源;而核因子κB(Nuclear factorκB，NF-κB)炎症通路的激活在下丘脑慢性炎症中起关键作用。另外，小胶质细胞，相当于中枢神经系统中的巨噬细胞，是中枢神经系统中的第一道也是最主要的一道免疫防线，与衰老和肥胖也有重要关联。然而一直以来研究人员对于下丘脑小胶质细胞在衰老和肥胖中所扮演的角色知之甚少。我们前期关于衰老的研究表明，NF-κB及其上游IκB激酶β(IκB kinase-β，IKK-β)的激活最早发现于下丘脑小胶质细胞中，再慢慢扩散至神经元。但下丘脑小胶质细胞IKK-β/NF-κB通路激活的起因以及其在衰老或肥胖发生发展中的具体作用尚未阐明。<br>　　小胶质细胞也是中枢神经系统内细胞因子的重要来源和作用部位，它通过大量细胞因子进行信号传导和免疫调节。其中，巨噬细胞集落刺激因子（Macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）、粒细胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)和粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）最初因能刺激造血祖细胞向巨噬细胞或/和中性粒细胞分化而命名，但是越来越多的研究表明，它们的作用不局限于血细胞生长因子，与其他细胞因子的紧密联系，使它们拥有更广泛的作用。相关的体外和体内实验都表明，这三种集落刺激因子对小胶质细胞有着重要的生物学作用。而且，研究者们已确认Mcsf, Gcsf和Gmcsf基因都是NF-κB的靶基因，相关报道称这三种集落刺激因子都在机体能量代谢中起关键作用。<br>　　另外，不同于经典的炎症反应是发生在感染等疾病条件下，引起衰老或肥胖的慢性炎症往往与胞内细胞器的能量代谢失衡有关，特别是细胞的“能量工厂”-线粒体。同细菌DNA一样，线粒体DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)为共价闭合环状双链分子，缺少组氨酸保护且含有大量未甲基化的CpG序列。在正常情况下，由于mtDNA存在于线粒体内，与免疫系统隔离而不被识别;但当线粒体损伤或膜通透性增加等原因导致mtDNA释放到线粒体外或细胞外，从而可能引起免疫反应。越来越多的研究报道当mtDNA释放到细胞外时，它可作为一种特殊的损伤相关分子模式(Damage-associatedmolecular pattern，DAMP)分子引起炎症。除重症感染和创伤外，在多种肿瘤中的血清或血浆中也发现这种游离线粒体DNA(Cell free mtDNA，cf-mtDNA)水平改变，学者们建议可将其作为一种非侵入性评价疾病的风险和预后的生物学标志物。但是目前，在衰老和肥胖的mtDNA研究中，主要关注的仍是mtDNA的突变、缺失或细胞内mtDNA含量的变化及作用，对cf-mtDNA的研究则较少。<br>　　因此本文遵循着由浅入深的原则，首先通过细胞体外研究，全面阐述cf-mtDNA诱导小胶质细胞炎症反应的机制;利用衰老、肥胖以及第三脑室套管小鼠模型，阐述衰老或肥胖对脑脊液cf-mtDNA和下丘脑集落刺激因子水平的影响，并解析下丘脑cf-mtDNA或集落刺激因子升高对小鼠代谢的作用;最后通过慢病毒转染技术和Cre-lox或Cre-STOP-lox系统建立下丘脑小胶质细胞IKK-β敲除和激活小鼠模型，进一步阐明下丘脑小胶质细胞NF-κB通路对衰老和肥胖的影响。<br>　　第1部分:cf-mtDNA诱导小胶质细胞炎症反应。我们首先采用振摇法和温和消化法相结合在原代混合培养的胶质细胞中分离出小胶质细胞和星形胶质细胞，并分别进行形态观察和免疫荧光染色等鉴定纯度。采用蔗糖密度梯度离心等从C57BL/6小鼠大脑中分离并纯化得到线粒体和细胞核，再分别采用碱裂解法和酚氯仿抽提法进行mtDNA和核DNA(Nuclear DNA，nDNA)分离和纯化。构建分别包含小鼠线粒体基因和核基因的两组标准质粒，建立检测mtDNA拷贝数的实时荧光PCR绝对定量方法。通过mtDNA或nDNA刺激BV-2小胶质细胞、原代小胶质细胞、原代星形胶质细胞、GT1-7神经元细胞、CAIKK-β(Constitutively active IKK-β)/BV-2小胶质细胞和DNIκBα(Dominant-negativeIκBα)/BV-2小胶质细胞等的体外实验发现小胶质细胞外游离的mtDNA增多可以灵敏地激活NF-κB通路从而引起小胶质细胞炎症反应并促使小胶质细胞集落刺激因子表达增高;而小胶质细胞外M-CSF增多又可进一步促进小胶质细胞外游离的mtDNA增多，G-CSF和GM-CSF增多反而促进小胶质细胞外游离的mtDNA减少。<br>　　第2部分:脑脊液cf-mtDNA和下丘脑集落刺激因子与衰老和肥胖的关系以及影响。我们采用小鼠延髓池采集脑脊液，并利用实时荧光PCR绝对定量方法测定小鼠脑脊液中cf-mtDNA拷贝数。通过比较老年小鼠（28～30月龄）和性别相匹配的年轻小鼠（3月龄）以及不同时间段的高脂饮食（High fat diet，HFD）小鼠和常规饮食（Chow，年龄和性别相匹配）小鼠，发现衰老和长时间(12周)HFD引起的肥胖会导致脑脊液中cf-mtDNA水平和下丘脑中集落刺激因子表达升高。通过第三脑室预先埋置套管，再通过第三脑室注射集落刺激因子或mtDNA，发现M-CSF会引起小鼠摄食量增加、体重增加和葡萄糖耐量受损;G-CSF、GM-CSF和mtDNA可以引起小鼠摄食量减少、体重减少和葡萄糖耐量受损。<br>　　第3部分:下丘脑小胶质细胞NF-κ B通路对衰老和肥胖的影响。我们采用在16周龄的Ikbkblax/lax小鼠的两侧下丘脑内侧基底部(Mediobasalhypothalamus，MBH)注射包装有CD11b启动子（小胶质细胞特有）和Cre的慢病毒，通过Cre-lox系统建立下丘脑小胶质细胞的IKK-βKO小鼠模型。术后即开始HFD喂养30周后改成chow喂养直至整个实验结束。通过监测体重、摄食量、全身核磁共振成像、代谢笼实验、葡萄糖耐量测试、抓力实验、尾腱断裂实验、肌肉和皮肤的组织学检测、Western blotting分析下丘脑NF-κB激活情况和荧光定量PCR分析下丘脑集落刺激因子表达情况等，发现在HFD喂养时小鼠下丘脑小胶质细胞IKK-β敲除具有抗肥胖作用，在衰老情况下小鼠下丘脑小胶质细胞IKK-β敲除具有维持体重并抵抗衰老的作用。我们还采用在16周龄的R26-StopFL Ikbkbca小鼠的MBH注射包装有CD11b启动子和Cre的慢病毒，通过Cre-STOP-lox系统建立下丘脑小胶质细胞的CAIKK-β小鼠模型。通过监测体重、摄食量、葡萄糖耐量测试和组织学检测（脂肪、肌肉和皮肤），发现小胶质细胞的IKK-β持续激活可以促进体重减少和促进衰老发展。<br>　　总之，本文揭示了小胶质细胞NF-κB通路介导的cf-mtDNA/集落刺激因子相互作用机制，并首次详细阐述了衰老和肥胖时下丘脑小胶质细胞NF-κB通路对能量代谢的双向调节作用，有望为进一步揭示小胶质细胞激活的原因和作用提供更广阔的研究方向，为延缓衰老或改善肥胖提供新的理论研究基础。