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摘要第一部分Alox15基因在脂氧素A4生成中的作用<br>　　目的：<br>　　本实验通过构建携带Alox15基因的慢病毒载体，并实现了该基因在血管内皮细胞内的表达。通过转染Alox15基因的血管内皮细胞(vascular endothelial cell，VEC)与中性粒细胞共培养，产生脂氧素A4(Lipoxin A4，LXA4)。该实验阐明了LXA4生成的新途径。<br>　　方法：<br>　　1.采用密度梯度离心法提取中性粒细胞。采用瑞氏染色法证明中性粒细胞的纯度，采用台盼蓝染色证实中性粒细胞的存活率。<br>　　2.构建含Alox15基因的慢病毒，并转染293T细胞。用ELISA法检测Alox15慢病毒滴度。<br>　　3.Alox15慢病毒转染血管内皮细胞。Western Blot和Real-time PCR法检测转染Alox15基因的血管内皮细胞的15-LO的表达。<br>　　4.15-20×105/ml的转染Alox15基因的血管内皮细胞与25-40×106/ml的中性粒细胞在37摄氏度共培养5h之后，加入100nM浓度的FMLP刺激15min，然后加入2倍体积的冰甲醇终止实验。ELISA法检测培养液上清液中脂氧素A4的浓度。<br>　　结果：<br>　　1.成功提取外周血中的中性粒细胞，分离纯化的中性粒细胞经瑞氏染色和台盼蓝染色证实纯度大于98％，存活率大于97％，分离的中性粒细胞在ECM培养基内培养。<br>　　2.成功构建含Alox15基因的慢病毒，转染293T细胞后在荧光显微下可见293T细胞呈绿色荧光。Alox15慢病毒滴度为5E+8(TU/ml)。<br>　　3.Alox15慢病毒成功转染血管内皮细胞，在荧光显微下可见血管内皮细胞呈绿色荧光。Western Blot法检测转染Alox15基因的血管内皮细胞表达15-LO的目的条带。<br>　　4.Real-time PCR法检测转染Alox15基因的血管内皮细胞15-LOmRNA稳定表达。Alox15慢病毒转染组与阴性对照病毒组Real-time PCR结果比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。<br>　　5.转染Alox15基因的血管内皮细胞与中性粒细胞共培养后采用FMLP刺激可以产生LXA4。<br>　　结论：<br>　　成功构建含Alox15基因的慢病毒载体，并实现该基因在血管内皮细胞内的稳定表达。含Alox15基因的血管内皮细胞与中性粒细胞共培养后，在FMLP的刺激下可以产生LXA4。该实验阐明了LXA4生成的新途径。<br>　　第二部分Alox15基因对大鼠急性胰腺炎的治疗作用及其机制<br>　　目的：<br>　　探讨Alox15基因对大鼠急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)的治疗作用及其可能的机制研究。<br>　　方法：<br>　　健康的成年雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠24只，将其随机分成为4组，每组6只:正常对照组（无病毒转染），急性胰腺炎组（无病毒转染+诱导急性胰腺炎），Alox15慢病毒组(Alox15慢病毒转染+诱导急性胰腺炎)，阴性对照病毒组（阴性对照慢病毒载体转染+诱导急性胰腺炎）。Alox15慢病毒组取5×107的Alox15慢病毒行胃左动脉灌注转染大鼠。正常对照组和急性胰腺炎组取等量的生理盐水行胃左动脉灌注大鼠。阴性对照病毒组取5×107的阴性对照慢病毒载体行胃左动脉灌注转染大鼠。大鼠胃左动脉灌注5天后，急性胰腺炎组、Alox15慢病毒组、阴性对照病毒组采用大剂量雨蛙素(caerulein)50μg/kg，每隔1小时腹腔注射，连续6h，总计6次，诱导建立大鼠急性胰腺炎模型。正常对照组用相同的方法给予腹腔内注射等量的生理盐水。第一次雨蛙素腹腔注射后9小时抽血，留取血清和胰腺标本，检测血淀粉酶浓度和血液中TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1浓度，检测胰腺湿干比，Real-time PCR行胰腺组织TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1、15-LO(15-lipoxygenase，15-LO) mRNA的检测，行胰腺病理学检查及病理学评分，免疫组化检测胰腺组织F4/80巨噬细胞的表达情况，流式检测胰腺组织内中性粒细胞比例的改变，TUNEL法检测胰腺腺泡细胞凋亡情况，免疫印迹(Western blot)检测胰腺内cleaved caspase-3和NF-κB的表达，胰腺组织送电镜检查。ELISA法检测血清及胰腺组织匀浆的脂氧素A4浓度。<br>　　结果：<br>　　携带Alox15目的基因的慢病毒载体成功的转染大鼠，通过荧光显微镜观察目的基因的荧光表达和Real-time PCR的方法检测胰腺组织15-LO mRNA的表达。Alox15基因表达能够减轻雨蛙素诱导的急性胰腺炎的血淀粉酶浓度、血液中促炎细胞因子(IL-6、MCP-1)浓度、胰腺组织TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1的mRNA的水平、胰腺湿干比、胰腺病理学评分;减少胰腺组织内中性粒细胞比例和巨噬细胞的数量;增加了胰腺组织内cleaved caspase-3蛋白的表达和胰腺腺泡细胞的凋亡;抑制胰腺组织内NF-κ B p65蛋白表达。电镜观察发现，Alox15基因的表达能够减少胰腺腺泡细胞细胞器的异常改变。Alox5慢病毒转染引起血清中LXA4的浓度升高。<br>　　结论：<br>　　转染Alox15基因对急性胰腺炎起治疗作用，可减少胰腺组织内中性粒细胞的浸润，能抑制胰腺组织内NF-κB的表达，从而减少胰腺组织内TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1的mRNA表达水平和血液中促炎细胞因子(IL-6、MCP-1)的水平；能稳定细胞结构，减轻急性胰腺炎时自噬功能障碍;诱导胰腺腺泡细胞的凋亡。Alox15基因对急性胰腺炎的作用机制可能与胰腺局部的15-LO浓度升高和血液中LXA4的浓度升高有关。