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摘要vlf-1是杆状病毒的核心基因之一，是所有杆状病毒中均存在的一个多功能基因。vlf-1编码的蛋白质VLF-1不仅介导杆状病毒极晚期基因的表达，而且作为结构蛋白定位在核衣壳的末端，参与病毒核衣壳组装。缺失实验表明，敲除vlf-1后病毒无法产生正常核衣壳，病毒失去感染性。<br>　　研究发现杆状病毒HearNPV的病毒粒子中VLF-1蛋白有两个丝氨酸位点被磷酸化。作为一种调控蛋白质功能的重要手段，病毒和细胞蛋白的磷酸化在病毒与细胞的互作过程中与病毒的生命周期密切相关。因此，推测VLF-1的磷酸化可能对其功能的发挥起重要作用。<br>　　序列比对发现在AcMNPV VLF-1的相同区域也存在两个丝氨酸位点，由于该两种病毒亲缘关系较近，因此推测其与HearNPV VLF-1一样也是潜在的磷酸化位点。本实验通过对AcMNPV中VLF-1上两个磷酸化位点进行突变来研究VLF-1的磷酸化位点的功能，为进一步研究磷酸化在杆状病毒AcMNPV的复制过程中的作用奠定了基础，同时为其他病毒的磷酸化位点研究提供参考。<br>　　本实验使用PCR方法将VLF-1上两个可能的磷酸化位点S218、S233突变成丙氨酸。在含有杆状病毒AcMNPV穿梭质粒的大肠杆菌中通过同源重组构建vlf-1缺失型质粒vlf-1-ko-AcBacmid。通过Bac-to-Bac表达系统将包含启动子区的vlf-1基因以及定点突变的vlf-1基因插入vlf-1-ko-AcBacmid质粒的polh基因座中构建拯救及磷酸化位点突变型重组病毒质粒。使用光学显微镜、荧光显微镜以及电子显微镜观察重组病毒在Sf9细胞中的复制情况，并通过绘制病毒一步生长曲线来定性分析VLF-1磷酸化位点突变对病毒复制的影响。最后，通过SDS-PAGE分析VLF-1磷酸化位点突变对极晚期基因polh表达的影响。<br>　　光学及荧光显微镜观察发现，磷酸化位点突变的重组病毒可以在Sf9细胞中复制，并观察到报告蛋白GFP表达以及荧光扩散。但是没有发现多角体的生成。一步生长曲线分析发现，磷酸化位点突变的重组病毒感染效率比野生型大大降低。电镜结果证实，在磷酸化位点突变的重组病毒粒子感染的Sf9细胞中存在大量不完全包装的空管状核衣壳。同时，正常包装的核衣壳同样出现在细胞中，这一部分包装完全的病毒粒子保证了病毒的感染能力。SDS-PAGE分析表明，与野生型相比，VLF-1磷酸化位点突变的重组病毒所感染的细胞中，极晚期基因polh的表达水平大大降低。<br>　　实验结果表明，VLF-1的磷酸化位点在杆状病毒AcMNPV的复制过程中发挥了重要的作用。磷酸化位点突变导致核衣壳的组装产生缺陷，使得病毒的感染效率大幅降低。通过对比vlf-1的缺失实验结果，我们推测，磷酸化位点的突变影响了VLF-1与其他病毒结构蛋白的相互作用，进而影响了核衣壳的最终装配过程。同时，位点突变也影响了VLF-1作为极晚期表达因子的活性，导致极晚期蛋白POLH的表达量大大降低。总之，VLF-1磷酸化位点在病毒核衣壳组装及极晚期基因表达过程中发挥了重要作用。