检索历史 清除

摘要目的：<br>　　本研究拟合成以不同含量的顺铂(CDDP)为交联剂，透明质酸为载体的纳米粒子包载抗肿瘤药物阿霉素(DOX)，形成纳米药物。通过比较不同粒径的透明质酸为载体的载药纳米药物对CD44受体表达高的乳腺癌及小鼠胚胎成纤维细胞(NIH-3T3)的治疗效果，研究纳米粒子对CD44受体表达水平不同的靶向细胞杀伤能力，阐明细胞对不同粒径的纳米药物的内吞情况，探讨不同粒径的纳米药物对乳腺癌的体内抑瘤效果，为探索交联为基础的纳米粒子包载抗肿瘤药物对乳腺癌的靶向治疗提供实验依据。<br>　　方法：<br>　　1、通过亲疏水作用合成以透明质酸为载体包载DOX的纳米药物，并从中筛选出载药率最高的载体与药物比例（载体与药物比例为5∶1）;<br>　　2、在最佳药物与载体比例基础上，加入不同含量的CDDP，以合成不同粒径大小的纳米药物(HA-DOX-CDDP)，并对载药率及粒径进行测量:用动态光散射法(DLS)和透射电镜(TEM)检测纳米药物粒径大小;用紫外光分度计来计算纳米药物的载药率;根据载药率及粒径结果选出HA1、HA3、HA5作为实验对象;<br>　　3、体外不同pH条件(37℃，pH7.4和pH5.5)模拟体内肿瘤环境下纳米药物的释放情况;<br>　　4、采用激光共聚焦术(CLSM)检测细胞对不同粒径的纳米药物的内吞及药物释放情况，并用流式细胞仪进一步观察细胞对药物的内吞情况;<br>　　5、采用MTT比色法检测不同粒径的纳米药物对CD44阳性表达小鼠乳腺癌细胞与CD44阴性小鼠胚胎成纤维细胞的增殖抑制效果;<br>　　6、比较不同粒径的纳米药物及游离药在体外3D培养条件下对4T1细胞球的增殖抑制作用;<br>　　7、使用不同粒径的纳米药物及游离药对荷瘤小鼠进行治疗，观察治疗效果，采用H&E染色及免疫荧光对小鼠器官及肿瘤组织进行观察，进一步观察治疗效果的差异。<br>　　结果：<br>　　1、通过亲疏水作用将不同含量的DOX包载入透明质酸的载体中（载体与阿霉素质量比分别为1∶1、5∶4、5∶3、5∶2、5∶1、10∶1），通过载药率的测量，选定比例5∶1为最佳比例，进行后续实验;<br>　　2、不同含量的CDDP(透明质酸中羧基与铂的摩尔比分别为10∶1、30∶1、50∶1、70∶1、90∶1、120∶1)加入包载阿霉素的纳米药物后，标记为HA1、HA2、HA3、HA4、HA5、HA6，通过对纳米药物的化学表征，结果显示不同含量CDDP的加入，得到的纳米粒径分别为112、61.1、53.2、53、36.2、30.4 nm，载药率分别为2.0％、2.5％、4.3％、4.9％、3.9％、4.8％，本实验主要研究纳米粒径对治疗效果的影响，并综合载药率的高低，故选择比例10∶1、50∶1、90∶1作为后续实验的研究对象，标记为HA1、HA3、HA5;<br>　　3、体外模拟体内不同pH(7.4、5.5)环境下DOX的释放实验结果显示:pH7.4环境下HA1、HA3、HA5的药物释放分别为28.48％、22.39％、34.56％，pH5.5条件下HA1、HA3、HA5的药物释放分别为44.22％、44.28％、53.18％。随着pH的降低，药物释放量明显增加，这是由于纳米药物中含有酯键，具有酸敏感性，可在酸性环境中发生断裂。<br>　　4、细胞对纳米药物的内吞实验结果表明:(1)、用激光共聚焦检测的结果显示，两种细胞中游离药物内吞量相差不大，而纳米药物在2h作用后即可被4T1细胞大量内吞，而3T3细胞则内吞很少，说明纳米药物载体对4T1细胞具有靶向性;(2)、用FCM检测的结果显示:与对照相比，用DOX浓度为5μg mL-1处理4T1细胞和3T3细胞2h后，游离药的内吞均比纳米药物多，且3T3细胞中游离药物内吞量比纳米药物的内吞量多的量比4T1细胞中多的量多很多。<br>　　5、纳米药物对细胞的靶向性及细胞毒性结果显示:随着药物浓度的增加，纳米药物及游离药物对细胞的增殖抑制作用逐渐增强。在相同DOX浓度(0.16、0.31、0.63、1.25、2.5、5、10μg mL-1)下，纳米药物对CD44高表达细胞(4T1)的细胞抑制作用比对阴性细胞（NIH-3T3细胞）的细胞抑制作用强，细胞凋亡率高。用DOX浓度为10μg mL-1的纳米药物与游离阿霉素处理48h后，CD44高表达的4T1细胞的存活率分别为HA1∶6.45±0.4％、HA2∶7.16±0.49％、HA3∶10.58±0.53％、DOX∶11.47±0.79％、DOX+CDDP∶8.75±0.33％。CD44低表达的3T3细胞的存活率分别为HA1:18.89±0.80％、HA2:23.50±3.92％、HA3:26.59±2.72％、DOX:24.25±1.43％、DOX+CDDP:14.42±0.39％。由此可见，纳米药物载体透明质酸对CD44受体有靶向性，其靶向抑制CD44高表达细胞的增殖作用比CD44低表达的细胞强。<br>　　6、体外3D培养4T1细胞球实验结果表明随着与药物共培养的时间的延长，细胞球周围细胞死亡越多。细胞球体积的统计结果药物之间差异并无统计学意义。加药(51μg mL-1)24h后CLSM下观察药物的内吞情况发现HA1在细胞球中扩散较均匀，HA3组药物多集中在球内部，HA5内吞不多。加药72h后的观察结果显示随着时间的延长，HA5组药物内吞增多，而HA1、HA3减少。而在不同时间点中，游离药组荧光均较弱。这可能是由于增强的渗透和滞留(EPR)作用。<br>　　7、小鼠体内4T1原位乳腺癌的抑瘤实验结果表明:在注射药物浓度相当于DOX5 mg kg-1治疗小鼠原位乳腺癌五次后，游离药物组小鼠的体重下降较明显(p＜0.01)，而纳米药物组小鼠体重则变化不大。治疗结束后，对照组的肿瘤生长迅速，药物组的小鼠肿瘤的生长得到抑制(p＜0.01)，其中HA1与HA5治疗效果相当，HA3与游离药治疗效果相当。对小鼠的脏器（心、肝、脾、肺、肾）及淋巴称重后计算的脏器指数可看出空白组的小鼠脾脏明显较其他组大很多，游离药物组的肝脏较其他组稍小。治疗后小鼠各组肺部照片可看出，纳米药物治疗后小鼠肺部结节减少且体积变小，而游离药物组则变化不大。对小鼠的器官及肿瘤部位组织切片的H&E染色结果可看出，游离药物组肝脏呈一定程度的损伤，而纳米药物组则损伤不明显。通过对survivin和PARP两个凋亡相关蛋白进行荧光染色后，结果与抑瘤结果一致。<br>　　结论：<br>　　以CDDP为交联剂透明质酸为载体包载DOX的纳米药物具有CD44受体靶向性及pH敏感性，体外可抑制CD44受体阳性的乳腺癌细胞4T1细胞的增殖，并抑制小鼠体内乳腺癌的增殖，降低了药物的毒性。这与纳米载体的CD44受体靶向性有关，同时也与纳米药物进入体内后可在肿瘤的微环境影响下酯键断裂释放抗肿瘤药物，同时与DOX和CDDP的协同作用有关。