检索历史 清除

摘要类转导素剪切增强因子(TLEs)家族成员序列中主要包含两段保守的结构域（序列同源性均高于70％），即N端的谷氨酰胺富集结构域(Q rich domain)和C端的色氨酸和天冬氨酸重复结构域(WDR domain)。其中C端的WDR domain主要负责与其他蛋白发生相互作用，目前结构已获得解析。N端的Q rich domain主要负责自身低聚化，并且功能实验证明TLEs蛋白只有在N端Q rich domain低聚化后才能发挥广泛的基因表达抑制活性。本课题主要研究TLEs家族中的TLE1蛋白，其在很多与生长发育相关的信号通路中发挥了重要功能（如Notchsignaling，Wnt signaling，EGFR signaling等），并且它也与一系列恶性肿瘤的发生相关。同时研究发现在某些组织器官中存在一种特殊的含Q rich domain的蛋白N端剪切增强因子(AES)，其与TLEs家族成员的Q rich domain相比同源性高达65％，因此也属于TLEs超家族成员。特殊之处在于AES只包含N端的Q rich domain和小段的甘氨酸和脯氨酸富集结构域(GP domain)，没有丝氨酸和脯氨酸富集结构域(SP domain)和C端的WDR domain。此蛋白在Notch signaling中发挥重要作用，并且还与某些癌症的恶性转移相关。通过免疫共沉淀实验证明了TLE1和AES两者存在相互作用，荧光共定位实验表明两者共定位于细胞核中，并且TLE1能显著提高AES对癌症迁移的抑制性活性。目前课题主要有以下三个方面的结果:一、获得TLE1 Q rich domain的晶体和低分辨率的数据，并尝试了多种晶体优化方法;二、对AES蛋白进行了表达纯化，已获得纯度较高的目的蛋白;三、验证了TLE1和AES Q rich domain之间存在相互作用，并已获得稳定的二元蛋白复合物。<br>　　内吞作用是细胞外的大分子物质和颗粒进入细胞的重要方式，它在细胞的营养吸收，免疫调节，信号转导，神经传递，细胞凋亡和发育的过程中都发挥了非常重要的作用。内吞作用最初形成的膜泡成为早期的内吞体，早期内吞体中包含了一些可以重复利用的组分和一些最终要被降解消化掉的组分。这些可以被重复利用的组分，会通过循环内吞体(recycling endosome)被重新运回到细胞膜上;而最终要降解的组分则会积累在内吞体中通过早期内吞体的不断融合转变为晚期内吞体，然后晚期内吞体与溶酶体融合后在溶酶体中最终完成降解和消化。内吞体代谢的调控从酵母到哺乳动物具有非常高的保守性。之前在酵母中的很多研究表明，Mon1p和Ccz1p两个蛋白可以形成稳定的复合物，参与到细胞内的膜泡融合过程中（酵母中的膜泡是与高等动物中的内吞体相似的细胞器），它们很可能通过与SNAREs复合物或者Ypt7(酵母中Rab7的同源蛋白)之间的相互作用而发挥功能。后来在线虫和小鼠中证实，Mon1蛋白和Ccz1蛋白形成的复合物是在Rab5和Rab7的交替过程中发挥了重要的功能。Mon1蛋白自身可以特异性的结合Rab5蛋白或者Rab5的GEF蛋白Rabex5后将Rab5蛋白的功能阻断，同时它与Ccz1形成复合物后具有针对Rab7的GEF活性，可以募集并激活Rab7，从而完成早期到晚期内吞体代谢过程中Rab5和Rab7的有序交换。目前在Mon1和Ccz1广筛条件中观察到一种块状蛋白晶体，我们尝试了不同方法去验证其是否为目的蛋白或降解片段生长出的晶体，下一步将通过晶体结构解析来阐述它们之间的相互作用方式和生物学功能。同时我们也表达纯化了Mon1和Ccz1在其他物种中的同源蛋白，希望能获得这些同源蛋白的晶体结构，并且通过比对分析这些结构来解释它们在内吞体早期到晚期转变过程中发挥功能的机制。