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摘要本文主要从以下几方面进行论述：<br>　　第一部分 慢性淋巴细胞白血病中CD8+T细胞的临床意义及PD-1表达<br>　　目的:在慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞的微环境中间充质干细胞、单核细胞来源的呵护样细胞、M2样巨噬细胞和T细胞等可支持CLL细胞的生存。部分CLL患者存在免疫异常。本研究旨在研究T细胞数量改变及其临床意义，以及T细胞变化包括亚群及PD-1表达。<br>　　方法:分析了234例初诊CLL患者的T细胞亚群，分析CLL患者的CD4+T细胞和CD8+T细胞数量与不同的临床和生物学特征的关系以及在CLL中的临床意义。通过流式细胞术(FCM)检测了液氮冻存的22例CLL外周单个核细胞(PBMC)和10例年龄匹配的健康供者的PBMC中CD8+T细胞PD-1表达。收集了11例CLL（9例未治疗和2例复发）患者PBMC和11例年龄匹配的健康供者的PBMC，通过FCM检测T细胞各亚群比例和抑制性受体PD-1表达。<br>　　结果:与年龄匹配的正常供者相比，CLL患者的外周血CD8+T细胞的平均绝对细胞计数增加(p=0.020)，而CD4+T细胞的平均绝对细胞计数无明显差异(p=0.108)。以CD4+/CD8+T细胞比值≤1为比例倒置，54例(23.1％) CLL患者有CD4+/CD8+T细胞倒置，比值倒置的患者分期较晚(Binet C期)(p=0.039)，而与免疫球蛋白重链可变区(IGHV)基因突变状态(p=0.298)、CD38(p=0.054)、ZAP-70(p=0.098)、p53突变/缺失和细胞遗传学异常(p=0.105)间无统计学差异。CLL患者中CD8+T细胞PD-1的表达要明显高于正常对照组，具有显著性差异(p=0.001)。CD4+/CD8+T细胞比值倒置CLL患者组的至首次治疗时间(TTFT)和总生存(OS)均短于比值正常的CLL患者(p=0.031和p=0.039)。CLL患者中CD8+T细胞PD-1的表达要明显高于正常对照组，具有显著性差异(p=0.001)。比较11例CLL患者和11例年龄匹配的健康供者的PBMC T淋巴细胞，CLL患者CD4+T细胞和CD8+T细胞中童贞T细胞(Tnaive:CCR7+CD45RA+)、中央型记忆T细胞(Tcm: CCR7+CD45RA-)、效应性记忆T细胞(Tem: CCR7-CD45RA-)和终末分化的效应T细胞(Teff: CCR7-CD45RA+)所占比例无明显差异，CD4+T细胞亚群PD-1表达均明显增加(p＜0.001)，CD8+T细胞的童贞T细胞亚群(p=0.002)、效应性记忆T细胞亚群(p＜0.001)和终末分化的效应T细胞亚群(p=0.001)PD-1表达也均明显增加。<br>　　结论:部分CLL患者存在CD4+/CD8+T细胞比值倒置，可能是CD8+T细胞的相对增加导致。比值倒置的CLL患者预后不良。CLL CD8+T细胞PD-1表达增加，且与T细胞亚群分布无关。<br>　　第二部 分慢性淋巴细胞白血病中CD8+T细胞PD-1基因甲基化水平及对表达调控的研究<br>　　目的:既往文献报道及前期实验发现CLL CD8+T细胞PD-1表达增加，为探索PD-1基因的高表达潜在机制，本研究旨在探讨CLL CD8+T细胞中PD-1基因是否存在甲基化水平的异常，同时进一步研究基因表达能否受DNA甲基化调控。<br>　　方法:从CLL患者(n=15)和健康供者(n=10) PBMC中分离纯化出CD8+T细胞，通过焦磷酸测序检测的第一个（1 st）内含子(CR1)、近端启动子(CR2)和远端增强子(CR3)片段的DNA甲基化水平。荧光实时定量聚合酶链式反应检测PD-1 mRNA。双荧光素酶报告基因实验中将677bp的CR3 DNA片段克隆入带有启动子的pGL4.23质粒，经过或不经过甲基化转移酶M.SssI处理后转染HEK293细胞或Jurkat细胞。Jurkat细胞有或无佛波醇酯(PMA)和离子霉素(Ion)(PMA/Ion)刺激活化。检测的萤火虫荧光素表达强度通过海肾荧光素表达强度标准化，得到相对萤火虫荧光素酶活性，与对照pGL4.23质粒相比较。健康供者的PBMC与CLL患者的CD19+B细胞以4/1比例或1/4比例共培养，或以抗CD3抗体和抗CD28抗体活化或PMA/Ion刺激。72 h后检测PD-1表达水平及CR3区域甲基化水平。分离童贞CD8+T细胞，培养或活化6d后焦磷酸盐测序检测PD-1表达水平及CR3区域甲基化水平和qRT-PCR检测PD-1 mRNA表达。<br>　　结果:1st内含子区域(CR1)高度甲基化，而近端启动子（CR2）则是低甲基化状态，但在CLL患者的CD8+T细胞与健康供者相比无统计学差异，其中CR1区域CLL患者的CD8+T细胞有降低的趋势。CLL患者的CD8+T细胞PD-1 CR3区域CpG位点甲基化水平均明显降低(p＜0.050)。PD-1 CR3 CpG甲基化水平和PD-1 mRNA相对表达水平负相关(r=-0.529，p=0.043)。在HEK293细胞和Jurkat细胞中克隆入质粒的CR3能增强荧光素酶活性(p＜0.010和p＜0.010)，而甲基化后带有CR3的质粒对荧光素酶活性增强减弱(p=0.018和p=0.636)。随后通过T细胞活化或共培养实验发现伴随活化后的T细胞PD-1表达增强的是远端增强子中CpG位点4(p=0.002)和位点5(p=0.002)。活化后的童贞CD8+T细胞甲基化水平下降而PD-1表达增加。<br>　　结论:CLL CD8+T细胞PD-1远端增强子区域的甲基化水平降低，且与PD-1 mRNA成负相关。远端增强子能调控PD-1基因，而且甲基化后调控能力下降。<br>　　第三部分 慢性淋巴细胞白血病中CD8+T细胞全基因组DNA甲基化水平芯片结果及验证<br>　　目的:基于前期研究结果发现，CLL CD8+T细胞PD-1远端增强子甲基化水平下降，本研究旨在进一步探讨在CLL环境中CD8+T细胞是否存在更多的表观遗传学变化。<br>　　方法:10例CLL PBMC和5例年龄匹配的健康供者的PBMC，分选出CD8+T细胞，通过Illumina450K甲基化芯片技术来检测DNA甲基化水平，统计学分析比较后筛选出甲基化差异CpG位点及与之相关联的基因。采用实时定量焦磷酸测序方法在更多样本中验证测序结果，以及qRT-PCR检测mRNA。<br>　　结果:全基因组DNA甲基化芯片结果显示，当两组CpG位点甲基化水平差异＞0.25时被认为是DMC，5例健康供者和10例CLL患者CD8+T细胞间有312个甲基化差别CpG位点，其中199个为甲基化增加，113个为甲基化下降，共涉及206个基因，包括免疫相关基因TCRA、HLA-DQB1、HLA-DQA1、CCR6、HIVEP3、NFATC1和KLRG1。选择了基因TCRA、CCR6和KLRG1，采用焦磷酸测序验证甲基化芯片涉及的CpG位点。发现CLL CD8+T细胞TCRA近3'UTR的1个位点、CCR6启动子的6个位点和KLRG1的启动子的4个位点均下降。KLRG1平均甲基化水平与KLRG1 mRNA呈负相关，而CCR6无关联。<br>　　结论:CLL环境中的CD8+T细胞除了存在表型的变化还存在广泛的甲基化水平的改变。CLL CD8+T细胞的“疲劳”现象可能与基因表观遗传学异常有关。