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摘要目的：<br>　　严重窦性心动过缓是由心脏窦房结血供不足及其邻近组织病变所致的心动过缓并引起相关性心脑肾供血不足症状。使用迷走神经阻断剂治疗窦性心动过缓可明显提高患者心率，改善症状。但迷走神经阻断剂阿托品等存在使用麻烦、口干、前列腺增生者不能使用等多种副作用。尽管现代起搏技术已发展到较高的程度，但仍存在并发症等诸多问题，因此，探索新的治疗方法具有很大的临床应用价值与前景。<br>　　正常窦房结起搏频率的快慢是由交感神经与迷走神经共同支配的。通过抑制迷走神经，可以减弱其负性变时作用而达到提高心率的作用。乙酰胆碱作为迷走神经递质对调节心脏负性变时功能起很重要的作用。心脏迷走神经通过释放的乙酰胆碱(acetylcholine，Ach)，作用于心房肌细胞毒蕈样2受体(muscarinic2acetylcholine receptor，M2A-ChR)-G蛋白-IKACh通路，激活KAch(muscarinic acetylcholine-sensitive K+channel)，从而发挥其负性变时的作用。KAch存在于心脏的窦房结、房室结、心房肌细胞，少量存在于心室肌，乙酰胆碱引主要通过其发挥负性变时作用。KACh是x亚基Kir3.1/GIRK1(potassium inwardly-rectifying channel)和Kir3.4/GIRK4的四聚物，KACh通道的特性主要与Kir3.1有关，Kir3.1可增加KAch通道的活性。<br>　　本实验通过检测转染siRNA(Small interference RNA)前后体外培养大鼠心房肌细胞Kir3.1及Kir2.1基因mRNA含量的变化情况，并通过蛋白质印迹杂交(Western-blot)检测其蛋白质表达变化，利用膜片钳技术记录IKAch的变化，最终确定抑制Kir3.1基因效率最高的siRNA序列，继而合成带绿色荧光蛋白的重组慢病毒载体（Lenti-Kir3.1-shRNA-GFP），将其直接注射至大鼠窦性心动过缓模型窦房结区，观察其对窦缓大鼠心率的影响，探讨抑制乙酰胆碱对心率的影响以及建立生物起搏器的可行性。<br>　　材料与方法：<br>　　1.原代新生SD大鼠心房肌细胞的培养及鉴定<br>　　2.在GenBank上选取大鼠Kir3.1(Kcnj3)基因序列(序列号NM-005102)，拷贝其mRNA序列并粘贴在siRNA网上设计软件optiRNA上，选取三条靶序列，由上海吉玛公司完成三个siRNA干扰序列的合成。<br>　　3.转染siRNA片段至原代培养的大鼠心房肌细胞，RT-PCR检测Kir3.1及Kir2.1mRNA的表达情况，筛选出干扰效率最高的片段应用于后续实验的转染;同时进行Western-blot检测Kir3.1及Kir2.1基因蛋白表达的变化。<br>　　4.采用膜片钳检测乙酰胆碱钾电流的变化：采用膜片钳全细胞方式记录IKAch并进行电流电压曲线分析。<br>　　5.重组慢病毒载体Lenti-Kir3.1-shRNA-GFP的构建：由上海吉玛制药技术有限公司设计并合成。<br>　　6.大鼠窦性心动过缓模型的制作及慢病毒载体转染：以20％甲醛化学消融大鼠窦房结区，以心率下降30％以上且稳定30分钟为窦性心动过缓模型成功。将慢病毒液多点注射至窦房结区。<br>　　7.术后第3天、第1、2、3、4周记录心电图。术后第4周将大鼠窦房结区组织制作冰冻切片，并于荧光显微镜下观察。<br>　　8.Westernblot及Real-time PCR检测窦房结区Kir3.1蛋白及mRNA的表达情况。<br>　　9.实验数据以均数±标准差（(x)±S）表示，应用SPSS13.0统计软件分析。组间差异化比较采用单因素方差分析，P＜0.05提示有统计性差异。<br>　　结果：<br>　　1.小干扰RNA(siRNA)的筛选结果：原代心房肌细胞分别转染3对候选siRNA24h后，Real-time-PCR检测发现siRNA-3抑制率最高。<br>　　2.转染Kir3.1-siRNA72h后RT-PCR检测发现Kir3.1mRNA表达量明显下降达45±5％，Western-blot检测发现Kir3.1蛋白水平下降19±2％，而Kir2.1mRNA及蛋白质水平无明显变化。<br>　　3.转染siRNA后IKACh的变化情况：乙酰胆碱敏感性钾电流转染组电流强度明显低于对照组。<br>　　4.术后4周窦房结区组织冰冻切片荧光显微镜下可见明显GFP荧光表达。<br>　　5.窦缓大鼠窦房结区注射重组慢病毒载体后心电图检查显示实验组术后3天大鼠心率即开始明显提高，直至术后4周，较对照组提高达15.4±3.8％;对照组术后4周内心率变化不明显。<br>　　6.Real-time PCR及Western-blot检测显示术后4周大鼠窦房结区Kir3.1基因mRNA含量及蛋白表达变化较假手术组分别下降42±7％和31±7％。<br>　　结论：<br>　　1.采用RNA干扰方法可以成功抑制Kir3.1基因表达，明显减少IKACh电流强度且不影响Kir2.1基因的表达;<br>　　2.不同siRNA序列抑制Kir3.1基因表达强度不同，本实验成功筛选出抑制效率最高的siRNA。<br>　　3.慢病毒介导RNA干扰实验性窦性心动过缓大鼠窦房结区心肌细胞Kir3.1基因表达可有效稳定提高心率，且在早期即可出现。<br>　　4.慢病毒载体可在动物体内实现长时间稳定表达，可能成为心动过缓等心血管病基因治疗的理想载体。