MscL表达纯化及其寡聚态的质谱解析-论文-万方医学网

MscL表达纯化及其寡聚态的质谱解析

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摘要高电荷机械敏感性离子通道(the Mechanosensitive channel of Large conductance，MscL)是生物膜离子通道中一种重要的膜蛋白，MscL作为一种能量释放阀可以在一定程度上防止细胞因渗透压的剧烈变化而裂解。关于这种膜蛋白的研究热点很多，MscL通道直径大小，生理功能以及不同实验方法得到的关于其低聚物形态不一致的观点。本研究主要研究MscL蛋白的低聚物形态问题，要想探究这个问题首先要做的是分子克隆将MscL基因片段插入到pET-28载体再做转化。其次使用IPTG诱导表达，优化表达条件后进行大量表达。对得到的菌体进行破碎，分离出脂溶性蛋白后使用AKTA系统进行纯化，得到很高纯度的MscL蛋白后做质谱分析。由于膜蛋白是脂溶性蛋白并且难结晶，所以在纯化和分析过程中添加表面活性剂DDM溶解膜蛋白，利用非变性质谱的高灵敏度的特点克服膜蛋白难结晶的困难。最后通过质谱检测MscL蛋白的低聚物形态。为了高效表达和得到更好的质谱信号，在本实验中还做了MscL蛋白与GFP(Green Fluorescent Protein)和TrxA(Thioredoxin)的融合表达。研究MscL蛋白为研究原核细胞膜离子通道提供了新的切入点和研究模型。