检索历史 清除

摘要放线菌天然产物在人类的疾病史上发挥着非常重要的作用，为人类贡献了许多抗生素。遗传操作在放线菌天然产物药物研究中扮演了极其重要的角色，而传统的同源重组方式往往由于周期长、依赖于筛选标记、筛选量大等劣势，极大地增加了工作量，同时也限制了其应用范围。因此，我们迫切需要完善放线菌的遗传操作体系，以更有效率地对放线菌次级代谢潜能进行挖掘研究。本实验室一直以来致力于放线菌天然产物挖掘，并且构建“万株基因组”库用于研究。对两种特殊的稀有放线菌海洋疣孢菌MS100137和嗜甲基拟无支酸菌，构建了基于CRISPR/Cas9的遗传操作体系，并将其初步应用于次级代谢产物的相关研究。<br>　　本研究主要内容包括：⑴在海洋疣孢菌中建立了高效的CRISPR/Cas9基因编辑技术，成功删除掉了长达90kb的片段，效率高于75％；⑵应用CRISPR/Cas9基因编辑技术对MS100137中NRPS基因簇进行删除工作，发现C17和C12与proximicins的生物合成相关，这两个基因簇均含有大量的未知功能基因，预示着其中有新的机制；⑶通过对MS100137菌株的发酵，发现在产物中仍然存在着很多的新颖proximicin类化合物，其中检测到一个相对分子量为307的proximicin，推测其结构是在proximicinA基础上增加了一个甲基，显示了proximicin的结构的多样性和活性潜能；⑷基于proximicin结构以及基因簇中基因的注释，对proximicin的生物合成通路进行了推测；⑸在嗜甲基拟无支酸菌中建立了CRISPR/Cas9基因编辑技术，在删除掉一个约60kb的amychelin合成基因簇片段的同时，导入了phiC31整合位点，效率高达100％，显示出CRISPR/Cas9技术强大的基因编辑能力，同时也为之后研究此类菌株打下了基础；⑹通过补料发酵amS基因敲除菌株产生的新化合物进行分离工作，分离到5个新的amychelin类化合物，获得的化合物中，4F-2在铜绿假单胞菌感染线虫模型上有着良好的拯救线虫，EC50为1.352μM。同时，通过多种水杨酸类似物的补料发酵，发现部分类似物如5F-水杨酸、5Br-水杨酸、4-甲基水杨酸等的补料发酵结果中也产生相应的新颖amychelin类似物。