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摘要葛根是一种药用植物，根部可作为药材，具有很高的药用价值，广泛用于治疗心脑血管疾病、糖尿病、肝病等疾病。葛根中的主要活性物质为葛根素、大豆苷等异黄酮类化合物，该类化合物具有具有抗炎、抗癌、抗氧化等特性。<br>　　糖基转移酶UGT(glycosyltransferases)能将UDP活化的糖分子转移到生物大分子上，是自然界最重要的修饰基因之一。异黄酮类化合物是植物中分布最广泛的此生代谢产物之一。在葛根中，UGT对黄酮类化合物进行糖基化修饰，合成异黄酮糖苷，在黄酮的合成、转运、存储等方面发挥了重要的作用。葛根素结构的特殊性在于葡糖糖基以C-C键与母环相连，而绝大多数异黄酮糖苷都以C-O键与甘元母环相连。葛根中存在2类对应的UGT，即碳苷糖基转移酶(CGT)和氧苷糖基转移酶(OGT)。<br>　　为了挖掘葛根中的UGT基因，本课题通过转录组测序找到了140多个UGT基因序列。通过与已知CGT和OGT进行序列比对分析，选定8个目标基因，分别命名为GT1、GT2、GT3、GT4、GT5、GT6、GT7、GT8，成功克隆基因，并通过蛋白原核表达及转基因大豆发根诱导技术初步验证基因功能。<br>　　将目标基因构建到原核表达载体上，将载体转入原核表达菌株Rosetta(DE3)中，用IPTG诱导蛋白表达。基因GT1、GT2、GT3、GT4、GT5、GT7、GT8均成功诱导出目标蛋白(51KD左右)，用超声破碎法提取蛋白，发现蛋白大部分出现在沉淀中，上清液中含量极少。在配好的反应体系中加入提取的GT蛋白上清液，发现GT4具有很强的糖基转移酶活性，能够催化大豆甘元、染料木素、芒柄花素、黄豆黄素合成对应的7-O-葡糖糖苷，且转化率很高，接近完全转化;GT4对甘草素和异甘草素无反应。由此说明GT4是特异性识别异黄酮并高效催化其合成7-O-葡萄糖苷的糖基转移酶基因。此外，发现GT1可催化芒柄花素合成芒柄花苷，但是活性很低。其他GT基因无糖基转移酶活性。<br>　　将目标基因构建到超表达载体pB7WG2D，转入发根农杆菌K599并侵染大豆子叶，诱导转基因发根产生。提取发根异黄酮类化合物，经过HPLC检测，结果发现与对照相比，超表达目标基因的发根中无葛根素，且异黄酮糖苷的含量也无显著差异。<br>　　本实验未能成功克隆催化葛根素合成的CGT，但是鉴定出一个新的糖基糖基转移酶基因，该基因具有很强的活性，可为后续研究及生产应用提供借鉴。