换一批
换一批摘要在手性药物合成过程中，脂肪酶作为一种高效的生物催化剂，能够催化拆分酯类药物中间体，得到手性药物中间体，用于后续的化学合成步骤。脂肪酶催化拆分酯类药物中间体的反应具有高效、简便、纯度高、产率高等特点，能够降低药物的生产成本。洋葱伯克霍尔德氏菌脂肪酶(BCL)是目前研究比较清楚，底物谱较为广泛的脂肪酶，具有很大的应用价值。本课题主要是应用实验室现有的洋葱伯克霍尔德氏菌脂肪酶A(BCLA)催化硫酸沃拉帕沙药物中间体拆分反应，并且用基因挖掘的方法找到一个新的脂肪酶片段BCLC，对其进行了底物特异性研究。<br> 洋葱伯克霍尔德氏菌脂肪酶A(BCLA)和折叠酶B(BCLB)基因工程菌，分别诱导表达，在BCLB的辅助下，对BCLA进行复性，获得可溶性蛋白。用可溶性BCLA催化拆分硫酸沃拉帕沙药物中间体4-乙酰氧基-N，N-二苯基-2-戊炔酰胺，并进行了条件优化，最终结果如下:温度60℃，pH7.0，反应时间4h，底物浓度1g/L，酶浓度0.028g/L，拆分后的底物ee值达94.5％，回收率42.86％。<br> 用BCLA的氨基酸序列在洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia ATCC25416)全基因组中进行比对，找到一个相似序列，命名为BCLC。通过构建大肠杆菌基因工程菌，诱导其表达蛋白，研究其催化酯类底物的特异性。研究发现，此片段对硫酸沃拉帕沙药物关键中间体4-乙酰氧基-N，N-二苯基-2-戊炔酰胺及衣折麦布药物关键中间体6-(4-氟苯基)-四氢-吡喃-2-酮、5-(4-氟苯基)-5-羟基-戊酸甲酯有拆分活性，ee值分别为78.49％、44.28％、60.86％。
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