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摘要目的:<br>　　质粒转移是细菌传播耐药基因的重要途径。质粒(plasmid)是的环形DNA，它不仅独立于细菌染色体，而且能自主复制。部分质粒具有转移性，并能携带抗生素耐药基因。广泛宿主质粒能穿梭于细菌间，因此质粒被视为传播耐药的关键媒介。质粒水平转移的主要途径是细菌的接合作用。接合作用(conjugation)是细菌借助性菌毛相互沟通、传受DNA的过程。因此，细菌接合作用被视为传播抗生素耐药基因的重要途径。AHL是细菌群体感应系统的信号分子。群体感应(quorum sensing，QS)是细菌感知群体数量变化，并调整群体行为的调控系统。其中，脂肪酰基高丝氨酸内酯(acylhomoserine lactones，AHL)是革兰阴性菌QS系统的信号分子，它通过结合LuxR类受体蛋白，实现调控基因表达。<br>　　蛋白SdiA是QS系统的受体蛋白，同时也是重要的转录因子。蛋白SdiA存在于大肠埃希菌中，能感知并结合其他细菌分泌的AHL。蛋白SdiA拥有DNA结合域，它能结合基因的启动子，以调控基因表达。因此，QS系统通过AHL-SdiA调控基因表达。<br>　　一般认为，质粒转移的调控是由质粒与宿主共同调控的过程，而受体菌参与接合调控则少有报道。本文推测，受体菌能通过QS系统调控质粒转移:受体菌分泌AHL，通过与宿主的蛋白SdiA结合，两者形成复合物，以调控接合相关基因traⅠ。其中，蛋白TraⅠ能结合质粒复制起始点oriT，参与质粒的复制及转移全过程，直接调控细菌接合作用。<br>　　因此，本文探究AHL-SdiA与基因traⅠ的调控关系。另外，本文发现蛋白SdiA对sRNA的调控作用，展望后续研究AHL-SdiA-sRNA对细菌接合作用的调控机制。<br>　　方法:<br>　　本实验采用大肠埃希菌SM10λπ作为质粒供体菌。该菌染色体被整合了质粒转移的调控元件(包含基因traⅠ)，并含有转移性质粒pUC24T。质粒pUC24T具庆大霉素(Gm)抗性，作为候选实验的筛选标记。受体菌则选用铜绿假单胞菌PAO1。PAO1基因lasI、基因rh1Ⅰ分别调控3-oxo-C12-HSL、C4-HSL的催化合成，后两者为PAO1最主要的AHL。<br>　　实验主要通过构建接合模型、运用荧光定量PCR(qPCR)检测基因表达量以及启动子报告质粒来验证实验假设。<br>　　构建接合模型。分别将供、受体菌培养至0.5麦氏浊度单位(MCF)。利用尿液分析仪测细菌浓度，并调配菌液浓度至1.0×107CFU/mL。供、受体菌各取100μ L，37℃混合培养6h。筛选合子并计数，换算接合频率。接合频率高，则说明接合作用则强。<br>　　qPCR检测基因表达量。收集待测菌液，并抽提细菌全RNA组。将RNA反转录为cDNA。以cDNA作为模板，利用qPCR检测目的基因相对表达量。<br>　　构建基因traⅠ启动子报告质粒pQF50-PtraⅠ。以质粒pQF50为载体，该质粒缺少Laz启动子。运用分子克隆技术，将基因traⅠ启动子及其上游317 bp片段，克隆于β-半乳糖苷酶基因上游。当基因traⅠ启动子被激活时，其下游β-半乳糖苷酶基因也被激活。后续通过β-半乳糖苷酶试验(ONPG试验)检测酶活性，便能反映出基因traⅠ启动子的表达状况。酶活性高，则说明基因traⅠ表达上调。通过该实验观察AHL-SdiA对基因traⅠ的调控情况。<br>　　结果:<br>　　①SM10λπ-PAO1进行接合反应。敲除PAO1基因1asⅠ、基因rhlⅠ，即AHL的缺失能提高SM10λπ接合频率(P＜0.001);若在此基础上，加入3-oxo-C12-HSL、C4-HSL干预接合反应，接合频率则降低（P＜0.05）。敲除SM10λπ的基因sdiA，能增加SM10λπ-PAO1接合频率(P＜0.001)。该结果提示，AHL与蛋白SdiA共同抑制SM10λπ接合作用。<br>　　②SM10λπ-EC600进行接合反应。其中，受体菌EC600为大肠埃希菌，自身不合成AHL。加入AHL干预，接合作用受抑制，SM10λπ-EC600接合频率降低(P＜0.001);而在敲除基因sdiA后，接合频率又回复至原水平。但是，在不加AHL干预时，在敲除基因sdiA后，SM10λπ-EC600的接合频率相近。该结果说明，AHL抑制接合作用依赖于基因sdiA的表达。至此，实验从表型上阐明了AHL-SdiA抑制质粒转移。<br>　　③SM10λπ-PAO1进行接合反应。敲除PAO1基因lasL基因rh1Ⅰ,即AHL的缺失能上调SM10λπ基因traⅠ表达（P＜0.05）。若在此基础上，加入3-oxo-C12-HSL、C4-HSL干预接合反应，SM10λπ基因traⅠ表达降低(P＜0.05)。敲除SM10λπ的基因sdiA，SM10λπ基因traⅠ表达上调（P＜0.05）。该结果从分子上阐明了AHL-SdiA抑制质粒转移。<br>　　④将含有报告质粒pQF50-PtraⅠ大肠埃希菌BW25113进行ONPG试验。加入AHL干预培养后，其β-半乳糖苷酶活性降低(P＜0.05)。而敲除BW25113基因sdiA或不加入AHL干预培养时，则均不降低酶活性。该结果说明，AHL-SdiA抑制基因traⅠ启动子。<br>　　⑤本实验通过生物信息学方法，预测并初步验证4条sRNA与基因sdiA调控成正相关性。敲除SM10λπ基因sdiA，能下调RnpB、SibA、SibB、EyeA等sRNA的表达。<br>　　结论:<br>　　实验通过SM10λπ-PAO1、SM10λπ-EC600接合模型，从表型上阐明AHL-SdiA抑制质粒转移。而后，通过qPCR检测基因traⅠ表达变化及pQF50-PtraⅠ启动子报告质粒实验，从分子水平阐明了AHL-SdiA抑制基因traⅠ启动子，从而抑制质粒转移。最后，实验发现数条sRNA受SdiA调控，为进一步探讨AHL-SdiA-sRNA抑制质粒转移机制指明了方向。