记忆相关基因KIBRA抑制Aβ诱导的神经元凋亡研究-论文-万方医学网

记忆相关基因KIBRA抑制Aβ诱导的神经元凋亡研究

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摘要研究背景: 　　阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种严重危害人类健康的进行性发展的神经系统退行性疾病，表现为认知功能不断恶化，日常生活能力进行性减退和丧失。据WHO和国际阿尔茨海默病协会估计，目前全球约有4700万人患有痴呆，预计2050年将达到13200万，已成为威胁人类健康的全球性的重大卫生问题。近年来针对AD的药物试验均以失败告终，其根本原因在于AD的发病机制仍不完全明确，尚缺乏有效阻断或延缓AD发生发展的治疗靶点，这是当前AD研究亟待解决的突出问题。 　　2003年，Kremerskothen等研究者首次描述了肾脑表达蛋白(kidney and brainexpressed protein，KIBRA)基因的特征，作为WWC蛋白家族的一员，仅特异性表达在肾脏（例如肾小球足细胞、肾小管及集合管）和记忆相关的脑区（例如海马和皮质）神经元细胞内。全基因组相关性研究发现KIBRA多态性位点与人类记忆及认知功能存在相关性，因此KIBRA又被称为记忆相关基因。由于记忆障碍是AD最主要的临床表现之一，KIBRA成为AD的又一个重要的候选基因。KIBRA通过结合伴侣共同发挥作用，不仅连接细胞骨架和信号分子，还参与多种细胞功能调节，包括细胞极性和迁移，囊泡转运，转录水平的调节，特别是对突触可塑性和记忆形成起到重要作用。在KIBRA基因敲除小鼠中，KIBRA的缺乏加速了α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid，AMPA)受体内吞，使突触后膜上的AMPA受体数目减少，引起海马区N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-asparticacid，NMDA)受体依赖的长时程增强(long term potentiation，LTP)和长时程抑制(long-term depression，LTD)的降低，导致KIBRA基因敲除小鼠的学习记忆障碍。 　　AD的核心病理改变为β-淀粉样蛋白(amyloid-β，Aβ)沉积形成的老年斑及高度磷酸化的Tau蛋白形成的神经原纤维缠结。Aβ在脑内的异常沉积，可诱发突触变性、氧化应激、炎症反应、神经元变性和凋亡等，最终导致AD的发生发展。最近在果蝇上的研究发现，KIBRA可作为调控囊泡转运的自噬调节因子，参与维持细胞自噬的正常功能，其缺乏会引起自噬囊泡形成和自噬降解的缺陷。一旦自噬囊泡产生或释放障碍，将会导致大量错误折叠蛋白异常蓄积，诱发细胞凋亡。因此，KIBRA的缺乏与细胞凋亡存在密切联系。目前研究已经证实了KIBRA与AD密切相关，Aβ引起的神经元凋亡在AD的发病机制中起重要作用，由此推测KIBRA可能参与Aβ诱导的神经元凋亡，因此我们的研究主要围绕着KIBRA在AD中的相关分子机制展开。 　　研究目的: 　　1.明确在AD转基因动物模型中是否存在KIBRA的表达改变; 　　2.明确KIBRA在神经元凋亡中的重要作用; 　　3.研究KIBRA参与Aβ诱导的神经元凋亡的相关机制。 　　研究方法: 　　1.动物模型:我们利用APPswe/PSEN1 dE9(APP/PS1)转基因小鼠及KIBRA基因敲除小鼠作为研究对象。APP/PS1转基因小鼠是目前AD研究领域应用较广泛的动物模型，购自美国Jackson实验室;KIBRA基因敲除小鼠是研究KIBRA生物学功能较理想的动物模型，由内布拉斯加大学医学中心董继鑫教授赠送。以同窝野生型小鼠作为对照，分别分笼喂养于光照/黑暗为12小时/12小时的恒温环境，自由摄食和饮水。 　　2.行为学检测:不同月龄的APP/PS1转基因小鼠接受Morris水迷宫检测，观察其认知功能的改变情况。先行平台实验，若在60秒内未找到平台，引导至平台，台上停留30秒。连续5天后，撤去平台，行探索实验，第一象限入水。Smart3.0软件录像跟踪系统记录，分析。指标包括逃逸时间（潜伏期）、探索路程、目标象限探索时间及路程、平台穿越次数等。 　　3.细胞培养及转染:小鼠海马神经元细胞系HT22购自美国加利福尼亚大学。使用含10％胎牛血清、100U/ml青霉素及0.1 mg/ml链霉素的高糖DMEM培养基，置于37℃、含5％ CO2的细胞培养箱中对细胞进行常规培养。根据细胞生长情况适时进行细胞传代、冻存或处理。细胞转染:生长状态良好的HT22细胞，病毒感染前一天铺六孔板，感染当天培养基中加入慢病毒悬液进行转染实验。细胞培养12-24小时后更换为完全培养基，转染72小时后进行荧光显微镜下观察GFP表达情况。 　　4.Aβ1-42寡聚体的制备与鉴定:本实验中Aβ1-42寡聚体的制备主要参照纽约Rochester医学中心William J.Bowers教授制备方法所进行的。简而言之，在生物安全柜中使用气密注射器将222μL六氟异丙醇(hexafluoroisopropanol，HFIP)加入室温平衡后的粉末状Aβ，充分混匀，得到浓度为1 mmol/L均质的Aβ-HFIP溶液。HFIP完全挥发，得到Aβ1-42的肽膜。然后加入适量的无水二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，充分振荡混匀、超声浴后得到5mmol/L的Aβ-DMSO溶液。继而加入适量PBS将其稀释得到浓度为50μg/mL(11.1μM)的溶液，4℃冰箱继续孵育2周，得到浓度为11.1μM的Aβ1-42寡聚体。每次使用前4℃13，000rpm离心10分钟，去除杂质。 　　5.免疫组织染色:组织经固定、脱水、包埋之后进行切片染色。免疫组织化学染色抗体使用浓度:Aβ，1∶400; Tau，1∶800; P-Tau Thr181，1∶400; KIBRA，1∶100;应用DAB体系显色。免疫荧光染色抗体使用浓度:Tuj1，1∶1000; KIBRA，1∶100;应用Alexa Fluor荧光二抗进行荧光染色。通过TUNEL染色检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。每种染色图片采集后应用Image J图像处理软件进行图像分析。 　　6.免疫蛋白印迹:RIPA缓冲液提取组织及细胞中蛋白，SDS-PAGE（8％、10％或12％丙烯酰胺）跑胶，转膜，孵育相对应的一抗。检测APP/PS1小鼠脑内KIBRA、Tau、P-TauThr181的表达水平;检测APP/PS1小鼠肠道KIBRA、Tuj1的表达水平;检测不同干预条件下细胞内凋亡相关蛋白的表达:活化的caspase3，剪切的PRAP;检测信号通路相关蛋白的表达:Akt总蛋白、P-Akt Ser473、PKCζ总蛋白、P-PKCζ Thr410、ERK1/2总蛋白及P-ERK1/2 Thr202/Tyr204。蛋白表达水平应用β-actin标化。免疫组织印迹条带采用Image J软件进行灰度分析。 　　7.统计学分析:应用GraphPad Prism5进行数据的统计分析。定量数据用均数±标准差（(X)±S）进行表示。两组间均数的比较采用t检验，多组间均数的比较采用ANOVA方差分析。当p值小于0.05时，差异有统计学意义。 　　研究结果: 　　1.不同年龄APP/PS1小鼠认知功能、脑内Aβ沉积及Tau蛋白水平 　　Morris水迷宫结果显示，9月龄和12月龄APP/PS1小鼠空间学习记忆能力比同窝对照小鼠均有下降，12月龄更为显著(p＜0.05，p＜0.01)。应用Aβ免疫组织染色方法，发现5月龄APP/PS1小鼠脑内开始出现Aβ沉积，至12月龄，大量的Aβ斑块沉积在皮层及海马区，而同月龄的野生型小鼠脑内始终没有观察到Aβ斑块沉积。免疫蛋白印迹分析，12月龄APP/PS1小鼠脑内p-Tau Thr181与总Tau表达量均明显高于对照组，两组之间存在显著统计学差异(p＜0.01，p＜0.05)。 　　2.KIBRA在APP/PS1转基因小鼠脑内特异性表达 　　通过KIBRA免疫组织染色分析，无论整个海马，还是海马亚区CA1区和CA3区，9月龄和12月龄APP/PS1小鼠KIBRA阳性细胞数量均明显低于对照组，其中12月龄尤为显著(p＜0.01，p＜0.001)。免疫蛋白印迹结果同样证实12月龄APP/PS1小鼠海马区KIBRA的表达明显低于野生型小鼠(p＜0.001)，两组小鼠皮层KIBRA的表达有升高趋势，但无统计学差异(p=0.0937)。我们进行了免疫荧光染色和共聚焦显微镜拍摄，发现KIBRA染色主要定位于神经元，而且与对照组小鼠相比，在12月龄APP/PS1小鼠海马区神经元中，KIBRA阳性染色减少(p＜0.05)，而皮层神经元中KIBRA阳性染色增高(p＜0.01)。随着月龄的增加，KIBRA在APP/PS1转基因小鼠海马区的表达逐渐减少，提示海马区KIBRA的特异性降低与AD的学习记忆障碍密切相关。 　　3.KIBRA在APP/PS1转基因小鼠肠神经系统特异性表达 　　研究发现，Aβ斑块和神经原纤维缠结不仅在AD患者脑内异常沉积，也出现在AD患者的肠管内，可引起线粒体功能障碍、氧化应激、神经元丢失等，从而导致肠道神经功能障碍。免疫荧光染色结果显示，12月龄APP/PS1转基因小鼠的肠道内有大量的Aβ沉积(p＜0.001)。我们进行了整体组织免疫荧光染色和共聚焦显微镜拍摄，发现与对照组小鼠相比，在12月龄APP/PS1小鼠的肠道神经元中，KIBRA阳性染色明显增多(p＜0.05)。免疫蛋白印迹检测同样验证了，在12月龄APP/PS1小鼠肠神经系统中KIBRA表达量明显高于对照组(p＜0.05)，而两组小鼠神经元标志物Tuj1表达量无显著差异(p=0.9023)。与海马区特异性降低不同，KIBRA在APP/PS1小鼠肠神经元中表达明显增高。 　　4.KIBRA在神经元凋亡中的重要作用 　　通过TUNEL荧光染色和共聚焦显微镜拍摄，我们发现，与野生型小鼠相比，12月龄APP/PS1小鼠皮层和海马区神经元凋亡比例明显增多(p＜0.01，p＜0.01)。4月龄KIBRA基因敲除小鼠海马区神经元凋亡比例比野生型小鼠明显增加(p＜0.05)，提示KIBRA在神经元凋亡的发生中扮演不可或缺的角色。 　　5.KIBRA对HT22细胞存活及Aβ诱导的神经元凋亡的保护作用 　　我们使用CRISPR/CAS9慢病毒及过表达慢病毒分别转染HT22细胞，建立KIBRA基因敲低和KIBRA基因过表达细胞模型。结果发现，与空病毒组相比，在接种96小时后， KIBRA敲低组细胞增殖受到抑制(p＜0.001)，KIBRA过表达组细胞增殖明显加快(p＜0.01)，提示KIBRA是细胞增殖的积极调控因子。 　　我们使用Aβ1-42寡聚体处理HT22细胞，建立Aβ神经毒性细胞模型。CCK8及免疫蛋白印迹结果显示，与空病毒组相比，经1μM的Aβ1-42寡聚体处理后的KIBRA敲低组细胞活力明显降低(p＜0.01);凋亡相关蛋白（剪切的PARP、活化的caspase3）的表达量明显增高(p＜0.05，p＜0.01)。KIBRA过表达组细胞存活率明显优于空病毒组(p＜0.05)，凋亡相关蛋白（剪切的PARP、活化的caspase3）较空病毒组显著减少(p＜0.05)，进一步提示KIBRA参与抑制Aβ诱导的神经元凋亡，促进细胞增殖和存活。 　　6.KIBRA通过激活Akt信号通路抑制Aβ诱导的神经元凋亡 　　本实验筛选凋亡相关信号通路，结果显示，在1μM Aβ1-42寡聚体处理1分钟后，空病毒组Akt Ser473位点磷酸化先被激活，KIBRA敲低组Akt Ser473位点磷酸化水平比空病毒组显著降低(p＜0.05);在1μM Aβ1-42寡聚体处理2分钟后，KIBRA敲低组Akt Ser473位点磷酸化才被明显激活。在Aβ1-42寡聚体处理1分钟后，KIBRA过表达组Akt Ser473位点磷酸化明显被激活，Akt Ser473位点磷酸化水平比空病毒组显著增高(p＜0.01)。 　　此外，免疫蛋白印迹结果显示，与Aβ1-42寡聚体干预组相比，MK2206+Aβ1-42寡聚体干预组KIBRA过表达细胞Akt Ser473位点的磷酸化水平显著降低(p＜0.05);剪切的PARP表达量明显增高(p＜0.05)。与Aβ1-42寡聚体干预组相比，MK2206+Aβ1-42寡聚体干预组KIBRA过表达细胞存活率明显降低(p＜0.05)。以上结果表明KIBRA通过激活Akt Ser473位点的磷酸化水平，抑制Aβ诱导的神经元凋亡。 　　结论: 　　1.随着月龄的增加，KIBRA在APP/PS1转基因小鼠海马区的表达明显减少。KIBRA在海马区的特异性降低与AD的学习记忆障碍密切相关，KIBRA作为记忆相关基因在AD的发生发展中起着重要作用。 　　2.KIBRA在海马神经元凋亡中起到不可或缺的作用。 　　3.KIBRA作为一种神经保护因子，通过激活Akt信号通路抑制Aβ诱导的神经元凋亡，促进细胞增殖及存活，为AD发病机制及治疗药物的研究提供了新的靶点。