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摘要研究背景和目的:<br>　　肾细胞癌是全球成人泌尿系统中最常见的恶性肿瘤之一。由于早期局限性肾细胞癌患者往往没有明显的症状和体征，容易造成肾细胞癌肿瘤的漏诊。数据显示大约有三分之一的患者在首次诊断为肾细胞癌时就已经伴有远处转移。而一旦处于晚期转移性肿瘤阶段，患者的预后是很差的。在肾细胞癌中，透明细胞型肾细胞癌是最常见的肾细胞癌组织学类型，也是其中侵袭性最强、致死率最高的肿瘤类型。因此对于肾透明细胞癌转移发生过程中的机制以及涉及其中的关键分子进行研究，对于肾透明细胞癌进一步分子分型以及未来针对性的阻止肿瘤转移发生的治疗是非常有意义以及临床应用价值的。<br>　　miRNAs是一类已经得到大量研究证实的，能够在多种肿瘤的发生、进展、耐药等生物进程中起重要作用的分子类型。之前的很多其他肿瘤中的研究已经报道了miR-193b-3p是一个重要的能够发挥抑癌作用的miRNA分子，miR-193b-3p在很多肿瘤组织中均发生了下调表达。本课题研究中，我们通过miRNAs表达谱芯片技术，在不同转移状态的肾透明细胞癌肿瘤组织之间，通过筛选差异表达的miRNAs分子时发现miR-193b-3p在伴有转移的肾透明细胞癌肿瘤组织中显著下调表达。进一步通过临床大样本的组织验证分析，我们证实了miR-193b-3p在miRNAs表达谱芯片中的结果。接着我们结合收集的肾透明细胞癌患者的临床病理参数、随访资料等明确了miR-193b-3p的表达量具有作为肾透明细胞癌预后预测分子的作用。接着在细胞表型水平和动物体内进一步验证了miR-193b-3p能够抑制肾透明细胞癌的增殖和转移的能力，并确定了在肾透明细胞癌中miR-193b-3p潜在的靶向基因。<br>　　材料和方法:<br>　　1、我们依据肾细胞癌患者首次术前诊断时是否明确诊断存在远处转移，分为原发转移和原发非转移两组，选取术后病理确认为透明细胞型的肾细胞癌患者的肿瘤组织病灶，每组3例，利用miRNAs表达谱芯片技术，进而筛选出两组间miRNAs的表达量存在着显著差异的miRNA分子。<br>　　2、我们应用qRT-PCR的方法，将miRNAs表达谱芯片筛选出的存在差异表达的miR-193b-3p，在原发转移和原发非转移肾透明细胞癌组织及其与之匹配的癌旁组织之间进行大样本量的实验验证，并且结合随访收集的肾透明细胞癌患者的临床病理资料以及患者的随访资料，分析miR-193b-3p的表达量与肾透明细胞癌患者的一些常见的临床病理参数以及患者预后之间的关系。<br>　　3、接着在体外细胞学层面，我们应用miR-193b-3p的抑制剂miR-193b-3pinhibitor和模拟剂miR-193b-3p mimics分别转染786-O和ACHN细胞株进行体外实验，采用慢病毒构建稳定过表达的miR-193b-3p载体进行体内实验。通过CCK-8实验、western blot实验、Brdu实验、克隆形成实验探讨miR-193b-3p对于肾癌细胞株增殖能力的作用，并通过裸鼠皮下荷瘤观察肿瘤生长以及对移植瘤进行免疫组化染色进一步确认。此外我们通过体外肿瘤细胞划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验探讨miR-193b-3p对于肾癌细胞株的迁移和侵袭能力的影响，并在建立尾静脉注射肾癌肺转移动物模型上通过体外荧光成像和肺组织HE染色进一步观察miR-193b-3p对于肾癌转移的影响。<br>　　4、接着我们结合转录组芯片中差异表达的mRNA以及miRNA靶向预测工具，应用双荧光素酶报告系统、qRT-PCR实验、westem blot实验、免疫荧光检测实验，探讨了在肾透明细胞癌中miR-193b-3p可能的下游靶向基因。<br>　　研究结果:<br>　　1、在原发转移的肾透明细胞癌和原发非转移的肾透明细胞癌肿瘤组织之间，通过miRNAs表达谱芯片筛选出差异表达的miRNAs共27个，其中下调表达12个，上调表达15个。结合差异表达倍数(Fold change)、错误发现率(FDR value)以及相关文献调研，选定miR-193b-3p进行进一步研究。<br>　　2、根据qRT-PCR检测结果分析，我们发现miR-193b-3p在肾透明细胞癌组织中呈现显著的低表达(P＜0.05)，并且在原发转移的肾透明细胞癌肿瘤组织中进一步降低(P＜0.05)。另外结合肾透明细胞癌患者的临床病理资料，我们发现miR-193b-3p的下调表达与临床晚期、高pT分级以及肿瘤阳性转移状态呈现显著相关。Kaplan-Meier生存分析发现肿瘤组织中低表达miR-193b-3p的肾透明细胞癌患者的术后肿瘤容易发生疾病进展、患者的预后生存较差。Cox多因素风险回归模型分析进一步分析发现miR-193b-3p的表达水平能够作为肾透明细胞癌患者疾病进展和生存的独立预后危险因素。<br>　　3、CCK-8实验发现，转染了miR-193b-3p inhibitor能够显著的增强肾癌细胞株的增殖能力，而转染miR-193b-3pmimics则显著的抑制了肾癌细胞株的增殖能力。Western blot实验发现转染miR-193b-3p inhibitor能够增强Ki-67以及PCNA这两个细胞增殖能力特异性抗原的表达，而转染miR-193b-3p mimics则显著抑制了Ki-67和PCNA的表达。Brdu实验发现敲减miR-193b-3p能够增加Brdu阳性细胞比率，而过表达miR-193b-3p则减少了Brdu的阳性细胞比率。细胞克隆形成实验也发现敲减miR-193b-3p会增加肾癌细胞的集落形成，而过表达miR-193b-3p则会减少肾癌细胞的集落形成。裸鼠体内实验中，我们发现稳定过表达miR-193b-3p能够显著地抑制裸鼠皮下荷瘤的生长。通过对裸鼠皮下荷瘤进行免疫组化染色发现Ki-67、PCNA以及CD31的表达显著受到了抑制。<br>　　4、细胞划痕实验表明转染了miR-193b-3p inhibitor的肾癌细胞划痕愈合能力显著增加，而转染了miR-193b-3p mimics的肾癌细胞划痕能力则显著收到了抑制。Transwell迁移和侵袭实验表明敲减miR-193b-3p的肾癌细胞株的迁移和侵袭能力得到了显著的增强，而过表达miR-193b-3p则显著抑制了肾癌细胞株的迁移和侵袭能力。通过尾静脉注射肾癌细胞建立肺转移模型发现，稳定过表达miR-193b-3p能够显著性地抑制肾癌肺微转移灶的形成。<br>　　5、双荧光素酶报告系统实验证实了miR-193b-3p能够直接靶向MCL1、MMP19和E2F6的3'UTR区域。qRT-PCR实验、western blot实验以及免疫荧光检测实验证实了miR-193b-3p能够抑制其靶向基因MCL1、MMP19和E2F6的mRNA和蛋白的表达。因此miR-193b-3p可能通过调节MCL1、MMP19和E2F6的表达在肾透明细胞癌中发挥抑制肾癌细胞增殖和转移的能力。<br>　　研究结论:<br>　　1、与癌旁肿瘤组织比较，miR-193b-3p在肾透明细胞癌肿瘤组织中显著下调表达，并在原发转移的肾透明细胞肿瘤组织中进一步下调表达。结合肾透明细胞癌患者的临床资料分析发现miR-193b-3p具备作为判断肾透明细胞癌患者预后生物标记物的潜质。<br>　　2、miR-193b-3p能够显著地抑制肾癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，在肾透明细胞癌的疾病进程中起着关键的抑癌作用。<br>　　3、在肾透明细胞癌中，miR-193b-3p能够靶向结合MCL1、MMP19和E2F6的3'UTR区，负性调控其靶向基因的表达发挥作用。