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摘要目的:<br>　　基于前期课题组鉴定的针刺抗哮喘靶标Transgelin-2蛋白，通过蛋白免疫印迹法检测Transgelin-2激动剂孵育后小鼠气管平滑肌细胞中信号通路蛋白磷酸化改变，为进一步明确针刺抗哮喘靶标Transgelin-2生物学功能和针刺舒张气管平滑肌效应提供新的线索和实验依据。<br>　　方法:<br>　　利用胰酶消化和差速贴壁法制备针刺抗哮喘靶标Transgelin-2基因敲除小鼠原代气管平滑肌细胞并进行鉴定;在小鼠原代气管平滑肌细胞裂解液中加入包被有Transgelin-2抗体的磁珠，利用pull down和质谱技术寻找Transgelin-2下游结合蛋白，并采用蛋白免疫共沉淀技术验证其相互作用。<br>　　分别给予野生型(WT)和基因敲除(KO)小鼠气管平滑肌细胞Transgelin-2激动剂TSG12和β2受体激动剂特布他林(TB)，检测WT和KO小鼠气管平滑肌细胞下游Ezrin和RhoA-ROCK-MYPT1-MLC、PKA-MLCK-MLC通路中蛋白磷酸化改变。<br>　　结果:<br>　　1.成功分离培养了针刺抗哮喘靶标Transgelin-2基因敲除小鼠原代气管平滑肌细胞(KO ASMC)，细胞纯度达95％以上。蛋白表达鉴定显示WT小鼠气管平滑肌细胞(WT ASMC)中Transgelin-2有显著表达，灰度值与β-actin比值为0.8;而在KO ASMC中Transgelin-2无信号，提示基因敲除成功。<br>　　2.利用pull down和质谱技术明确了Transgelin-2在小鼠气管平滑肌细胞中的结合蛋白是Ezrin(埃兹蛋白)。免疫共沉淀结果发现Transgelin-2抗体包被的磁珠和肺组织蛋白裂解液孵育后可获得Transgelin-2和Ezrin蛋白信号，Ezrin抗体包被的磁珠和肺组织蛋白裂解液孵育后也可获得Ezrin和Transgelin-2蛋白信号，从而确认两者存在相互作用关系。<br>　　3.在WT ASMC中，TSG12显著上调Ezrin(T567)蛋白磷酸化水平(P＜0.05);而在KO ASMC中表达没有显著升高，提示Ezrin蛋白磷酸化水平和Transgelin-2蛋白表达密切相关。<br>　　4.在RhoA-ROCK-MYPT1-MLC通路中，Transgelin-2激动剂TSG12可显著提高WT ASMC中RhoA(S188)蛋白磷酸化水平(P＜0.05)，降低ROCK(Y722)蛋白磷酸化(P＜0.05)并下调MLC(S20)蛋白磷酸化水平（P＜0.05），且TSG1290s孵育可以显著降低MYPT1(T853)蛋白磷酸化水平（P＜0.05），提示TSG12可能通过抑制RhoA和ROCK活性，降低MYPT1蛋白磷酸化表达，减少MLC磷酸化水平，实现气管平滑肌细胞舒张。<br>　　5.在PKA-MLCK-MLC通路中，TSG12不能调节PKA(T197)和MLCK(S1760)蛋白磷酸化水平（P＞0.05），而TB能够显著提高WT ASMC中MLCK蛋白磷酸化水平（P＜0.05），降低MLC(S20)蛋白磷酸化表达（P＜0.05），实现气管平滑肌细胞舒张，从而体现TSG12作用机制的特异性。<br>　　结论:<br>　　1.针刺抗哮喘靶标Transgelin-2下游结合蛋白是Ezrin，且Ezrin磷酸化水平和Transgelin-2蛋白表达密切相关。<br>　　2.激动针刺抗哮喘靶标Transgelin-2后，气管平滑肌细胞可能通过特异性抑制RhoA、ROCK活性，降低MYPT1蛋白磷酸化水平、增加MLCP(肌球蛋白磷酸酶)活力，最终降低MLC蛋白磷酸化，实现气管平滑肌舒张。