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摘要COP9信号复合体(Constitutive Photomorphogenic signalosome)，又称为CSN复合物，最初在对拟南芥种子植物发育的光形态发生的遗传学分析中被发现，是植物光形态发生的一个负调节子。该复合物的亚基组成和序列非常保守，提示CSN复合物具有相当保守的细胞生物学功能。CRLs是一个含有200多个不同成员的E3泛素连接酶家族，其中CRL4家族是由Cullin4，Rbx1，DDB1以及一类底物特异性受体蛋白(DCAFs，Ddb1 and Cul4-associate factors)组成，在DNA损伤修复以及基因组稳定性的维持方面有着重要的作用。CRL4家族的一种底物受体DDB2可以直接识别受损的DNA，启动DNA损伤修复。CSN复合物和CRL4 DDB2可以相互作用形成12元的复合物。<br>　　虽然研究人员提出CSN结合CRL4DDB2泛素连接酶会导致其活性被抑制，而DDB2对受损DNA的识别会使CSN从CRL4DDB2泛素连接酶上解离下来，但中间过程并不清晰。同时由于已经解析的CSNN8CRL4ADDB2的结构柔性大，导致其电镜结构分辨率低下，部分相互作用细节不甚清晰。我们的实验建立了昆虫细胞共表达体系，表达纯化了均一的CNS-CRL4ADDB2这12元复合物，并用负染电镜方法对蛋白样品进行了初步分析。<br>　　Pif1解旋酶家族在大部分真核细胞中都存在，它属于解旋酶中的SF1B家族，依赖ATP供能，从5'-3'解开双链DNA。Pif1在mtDNA的重组、修复和稳定性维持的过程中都发挥着重要作用。它可以修复在线粒体中由ROS引起的的DNA损伤，也可以帮助修复线粒体DNA中的双链断裂。同时Pif1也参与维持细胞核基因组稳定性，在细胞核内Pif1可以通过抑制端粒酶活性调控端粒长度，通过移除dsDNA断裂处的端粒酶促进DNA的修复。它还参与到冈崎片段的成熟，核糖体DNA复制和对G4结构的处理中。Rim1是一个核基因，编码的Rim1蛋白是线粒体中的一个单链DNA结合蛋白，对mtDNA复制非常重要，当细胞缺少这个基因时，细胞中就完全没有mtDNA存在。实验发现，Pif1与Rim1有直接相互作用，Rim1在OB-fold结构域和和C端都可以与Pif1相互作用。它们之间的相互作用可以提高Pif1的活性。<br>　　截止目前，酵母中的Pif1结构并未获得，同时Pif1与Rim1之间的具体相互作用也未阐明。而根据之前的实验显示，酵母的Pif1蛋白对G4结构有更强的解旋作用，因此研究酵母Pif1蛋白与Rim1蛋白，以及与DNA之间的相互作用仍是非常必要的。我们的实验获得了Pif1和Rim1的融合蛋白，进一步，我们希望探究Pif1蛋白与Rim1蛋白之间的相互作用，以及它们与G4 DNA之间的相互作用，从结构水平阐明它们之间的作用关系。<br>　　我们分别通过共表达和体外组装的方式，尝试了Pif1与Rim1复合物的制备，但由于二者的亲和力相对较弱，未能成功得到适于结构解析的稳定的复合物。因此我们选择了融合蛋白的策略，构建并表达了由一段Linker序列衔接的Pif1-Rim1的融合蛋白。纯化后得到的融合蛋白质电泳条带均一，经肽指纹质谱分析，与目的蛋白质完全吻合。该融合蛋白在进行分子筛层析时表现为一定程度的聚集状态，而非以单体状态存在。我们对该样品进行了了负染电镜分析，获得了初步的结果。进一步，我们想要获得更加大量和均一的样品，获得更高的分辨率结果。