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摘要目的:Wnt/β-catenin信号通路是细胞中一条即重要又保守的信号转导途径，在细胞的发育过程中起作用，参与调控胚胎细胞的生长，干细胞自我更新，淋巴细胞增殖及恶性肿瘤的形成，自噬与Wnt信号通路有着十分密切的关系。有研究证明自噬水平的增加会下调Wnt通路中关键蛋白β-catenin的表达，当细胞培养在饥饿条件下时，Wnt通路中泛素化蛋白Dvl会定位于自噬体中，和自噬的标志分子LC3有共定位。Beclin1是首个被发现的介导哺乳动物自噬的基因，B淋巴细胞瘤-2基因简称Bcl-2(B-cell lymphoma-2)，是研究细胞凋亡时最为重要的癌基因之一，BECN1与Bcl-2形成的复合体BECN1-Bcl-2/Bcl-XL具有抑制自噬的功能。运用STRING蛋白相互作用预测软件生成Wnt通路与Bcl-2及BECN1的相互作用关系网络图，探究在急性B淋巴白血病细胞系中它们的表达机制及对细胞自噬的影响。<br>　　研究方法:<br>　　(1)运用GESA基因探针富集分析生物信息学软件，从GEO数据库中提取40例急性B淋巴细胞白血病人及11例正常人芯片表达谱数据，进行统计分析，筛选差异显著基因。<br>　　(2)STRING蛋白相互作用预测软件，分析Wnt/β-catenin通路与自噬相关基因BECN1之间的联系。<br>　　(3)选用急性B淋巴细胞白血病细胞系BALL-1及对照组人正常母淋巴细胞系HMy2.CIR作为实验研究对象，EBSS缓冲液更换完全培养基饥饿法诱导细胞自噬。<br>　　(4)MDC特异性染色，检测诱导细胞自噬产生自噬小体，荧光显微镜下进行观察。<br>　　(5)流式细胞术检测两组细胞系诱导自噬后细胞凋亡比例。<br>　　(6)Western blot检测自噬标记蛋白LC3，用LC3B/A比值证明细胞自噬水平。<br>　　(7)Real time-PCR及Western blot检测Wnt/β-catenin信号通路相关基因与蛋白在两组细胞系中表达差异，检测诱导细胞自噬后Wnt通路靶蛋白β-catenin及下游蛋白的表达是否发生改变。<br>　　(8)Western blot检测自噬相关蛋白BECN1及抗凋亡蛋白BCL2在BALL-1及HMy2.CIR细胞系中的表达差异，检测诱导细胞自噬后，二者的表达是否受到影响。<br>　　(9)Wnt通路拮抗剂C59抑制BALL-1细胞中Wnt通路的表达，诱导细胞自噬后，Western blot检测细胞自噬水平的改变。<br>　　结果:<br>　　(1)GESA软件筛选出差异显著基因Wnt3及Wnt10a，它们同属于Wnt分泌蛋白家族中的成员，作为配体对激活Wnt通路起至关重要的作用。<br>　　(2)STRING分析网络图显示Wnt通路相关蛋白与自噬蛋白BECN1以抗凋亡蛋白BCL2为纽带相联系。<br>　　(3)MDC染色荧光显微镜下检测到饥饿法诱导自噬的细胞产生自噬小体，证明细胞自噬发生。<br>　　(4)流式细胞术检测BALL-1细胞系随着饥饿时间的延长，细胞死亡较少，HMy2.CIR细胞死亡比例高。<br>　　(5)Western blot检测自噬标记蛋白LC3B与LC3A比值，证明两组细胞系自噬水平，BALL-1在饥饿环境下2-3小时LC3B/A比值低，自噬水平低，5-6小时，LC3B/A比值升高，证明其自噬水平高;在对照组正常细胞系HMy2.CIR中，1-3小时自噬水平较高，5-6小时降低，同时伴随着大量的细胞死亡。<br>　　(6)Real rime PCR结果显示BALL-1细胞中Wnt3a，Wnt0a，LRP5，GSK-3β，β-catenin，TCF-4, c-Myc及cyclin-D1的m RNA表达水平分别约为对照组HMy2.CIR细胞系的34.7倍，13.4倍，29.5倍，6.73倍，8.41倍，8.3倍，8.13倍，58.7倍，差异显著;与对照组相比，P＜0.05具有统计学意义。Western blot结果显示，BALL-1中Wnt10a蛋白的表达高于对照组HMy2.CIR细胞系1.59倍，β-catenin蛋白比对照组高表达2.17倍，GSK-3β及C-myc蛋白与对照组相比分别高表达1.04倍及2.93倍;P＜0.05具有统计学意义。诱导细胞自噬1-6小时，BALL-1中β-catenin总蛋白表达无明显变化，磷酸化水平发生改变;HMy2.CIR中，β-catenin5-6小时表达下调，未检测出磷酸化条带。β-catenin下游蛋白在两组细胞系中都发生不同程度的表达改变。<br>　　(7)Western blot结果显示，BECN1蛋白在BALL-1饥饿诱导2h时表达上调，随后降低，在HMy2.CIR细胞中3小时表达较高，随后降低。Bcl-2在BALL-1中表达始终恒定，未受饥饿诱导自噬的环境所影响，在HMy2.CIR中5-6小时表达下调。<br>　　(8)加入Wnt通路抑制剂C59后，在正常培养情况下BALL-1加抑制剂组的自噬水平低于未加抑制剂，且白血病细胞系BALL-1自噬水平明显高于正常母淋巴细胞系Hmy2.cir。饥饿法诱导细胞自噬3小时及6小时后，BALL-1细胞加抑制剂组自噬水平上调，明显高于未加抑制剂BALL-1组及Hmy2.cir细胞系。<br>　　结论:<br>　　(1)急性B淋巴细胞白血病细胞系中细胞在应激环境下的自我修复能力比正常细胞系强，细胞可以维持正常的生长状态，不受血清饥饿的影响，同时随着时间的推移，细胞自噬能力也在不断增强。<br>　　(2)抑癌基因BECN1，作用于自噬激活阶段，在BALL-1中表达低于HMy2.CIR。饥饿诱导1-6小时后，在两组细胞系中都有短暂的升高，在自噬的前期被激活，随后表达降低。在无血清培养细胞的过程中，BECN1及BCL-2的表达都无明显差异，受细胞发生自噬影响并不显著。<br>　　(3)Wnt/β-catenin信号通路相关基因在急性B淋巴白血病细胞系BALL-1中表达明显高于HMy2.CIR细胞系，证明其参与调控该疾病进程。加入Wnt通路抑制剂后，正常培养条件下BALL-1自噬水平降低，当无血清饥饿法培养细胞在应激环境下时，BALL-1加抑制剂组细胞的自噬水平明显增强，证明Wnt通路参与调控细胞自噬过程。