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摘要目的:目前全球范围内非结核分枝杆菌(nontuberculousmycobacteria，NTM)的感染持续增多，而NTM与结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，Mtb)的治疗方案及疗程差别很大，因此有必要将Mtb与NTM区分开。然而，由于Mtb与NTM的临床及肺部影像学、痰涂片表现相似，且痰培养耗时较长，因此，早期快速区分二者非常困难。许多新的NTM检测技术越来越多的被研究，如:基于核酸扩增的DNA检测技术，酶联免疫吸附试验等血清学诊断方法等，但这些方法用于NTM的鉴定仍处于初级阶段。<br>　　抗原85(Antigen85，Ag)复合物(Ag85A，Ag85B，Ag85C)是主要的结核分枝杆菌分泌抗原，分子量30-32KD，作为分枝酰基转移酶在细胞壁合成中起到了重要作用。Ag85B首先在Mtb中鉴定，但在多种NTM中表达。通过酶免疫分析方法，结核Ag85B蛋白抗原或抗体已在血清、痰、脑脊液中被检测到，由于各分枝杆菌的Ag85蛋白间具有高度氨基酸序列同源性，蛋白质结构及功能亦相似，通过传统的免疫学方法难以区分，尚未见Ag85B在应用于诊断NTM的报道。<br>　　为了早期、准确的鉴别NTM及Mtb感染，并判断病情活动性，我们进行了本研究。在本实验中，可以通过HPLC-MS/MS识别氨基酸序列，检测Mtb或NTM感染病人的痰分枝杆菌培养上清或血清中的菌种特异性Ag85B目标肽段，从而研究其在临床分枝杆菌感染鉴别诊断及判断结核病活动性中的价值及临床意义。<br>　　研究方法:1、分枝杆菌Ag85B蛋白序列同源性分析与MtbAg85B蛋白标准品胰酶酶切分析，以选取菌种特异性目标肽段<br>　　通过分枝杆菌Ag85B蛋白序列比对结合Mtb Ag85B蛋白的理论胰酶酶切，选择可区分Mtb与NTM潜能的片段做为目标肽段。继之在Mtb Ag85B蛋白标准品胰酶酶切液中，验证目标肽段。<br>　　2、应用液相色谱分析在分枝杆菌标准菌株培养上清中验证菌种特异性Ag85B目标肽段，并建立血清中Ag85B检测方法学<br>　　应用强阳离子交换柱，除盐纯化富集胰酶消化的分枝杆菌培养上清中的肽，通过HPLC-MS/MS数据依赖性获取(DDA)模式，分析分枝杆菌培养液上清中Ag85B蛋白酶切片段组成。通过液相色谱仪平行反应监视(PRM)模式，扫描分枝杆菌培养液上清中菌种特异性Ag85B目标肽段，以提高信号强度及检测敏感性。最后通过模拟血清Mtb Ag85B标准抗原抗体结合、解离及Ag85B富集、酶切，建立液相色谱检测血清Ag85B的方法学。<br>　　3、在临床Mtb与NTM病人痰或血清样品中检测菌种特异性Ag85B目标肽段<br>　　采用HPLC-MS/MS分析PRM模式，在一次运行中检测如下临床样品中Mtb或NTM菌种特异性Ag85B目标肽段:87例肺结核病人、34例肺鸟-胞内分枝杆菌感染(MAC)病人、21例肺堪萨斯(M.kansasii)感染病人痰及血清标本;38例结核性胸膜炎病人（无痰或痰结核菌培养阴性）、41例肺外结核病人、48例潜伏性结核感染病人血清及36例健康对照者的血清样品。肺分枝杆菌感染病人经痰培养阳性确证，研究对象未包括HIV阳性及应用免疫抑制剂者。液相色谱数据通过软件在蛋白数据库中与相应蛋白及肽序列匹配，以确证鉴定菌种特异性Ag85B肽段，进而诊断Mtb及NTM感染。<br>　　结果:1、可鉴别Mtb及NTM的分枝杆菌Ag85B蛋白目标肽段的选择<br>　　12种在UniProt蛋白数据库中被预测可能分泌Ag85B的分枝杆菌菌株的Ag85B氨基酸序列全长比对，提示了高同源性。与MtbAg85B蛋白序列比较，常见感染的NTM如MAC及M.kansasiiAg85B蛋白展现了同Mtb较高的、超过80％的氨基酸序列同源性。Mtb Ag85B蛋白的理论胰酶酶切发现，肽NDPTQQIPK(m/z520.77，2+)显示了可区分Mtb与NTM的潜力，并在Mtb Ag85B蛋白标准品的胰酶消化的多肽液中验证了该目标肽段。<br>　　2、Ag85B菌种特异性氨基酸序列在Mtb及NTM菌株培养上清中的验证及Ag85B抗原抗体复合物解离试验方法学验证<br>　　包括Mtb及常见NTM的14种分枝杆菌菌株的培养上清，液相色谱DDA模式分析表明，肽m/z520.77及其Ag85B同源性序列在Mtb，MAC，M.kansasii及M.scrofulaceum的菌株分泌蛋白中被检测到。在上述标准菌株培养上清中液相质谱PRM模式扫描结果，进一步检证了上述Ag85B菌种特异性目标肽段序列，且肽信号强度显著增加。在体外模拟Mtb Ag85B抗原抗体复合物结合并掺入非结核病人血清，按照上述方法学应用液相色谱可检测到Ag85B菌种特异性目标片段。<br>　　3、在临床病人痰或血清样品中检测Mtb或NTM<br>　　通过酶切后液相质谱检测的方法，在所有肺结核病人、肺MAC感染病人及肺M.kansasii感染的病人的痰结核菌培养液上清中检测到了相应的菌种特异性Ag85B目标肽段，而在空白对照培养液中未检测到Ag85B片段，敏感性及特异性均为100％。通过液相色谱检测分枝杆菌Ag85B菌种特异性目标肽段，在34例MAC感染病人血清中检测的敏感性为88.2％，在21例M.kansasii感染病人血清中诊断的敏感性90.5％，在36例健康者的血清中未检测到任何分枝杆菌Ag85B目标片段，特异性为100％。在87例肺结核病人血清中检测的敏感性为93.1％，在38例结核性胸膜炎及41例肺外结核的病人中，诊断的敏感性分别为92.1％及92.7％，在48例潜伏性感染结核者中没有检测到Mtb目标Ag85B肽段，因此液相色谱检测活跃性结核感染（合计166例）敏感性为92.7％，特异性为100％。<br>　　结论:1、分枝杆菌Ag85B氨基酸序列的同源性较高，同Mtb相比，常见感染的NTM如MAC及M.kansasii Ag85B蛋白氨基酸序列同源性超过80％。蛋白序列比对提示肽NDPTQQIPK(m/z520.77，2+)及其同源性序列可做为液相质谱目标片段鉴别Mtb与NTM。<br>　　2、在Mtb，MAC与M.kansasii的标准菌株培养上清中，可通过液相质谱扫描验证相应目标Ag85B菌种特异性肽段，从而鉴定Mtb及NTM。<br>　　3、可通过一次液相色谱运行，完成每个痰或血清标本中菌种特异性分枝杆菌Ag85B目标肽段的序列分析，可早期、快速、准确鉴别Mtb及NTM感染，可检测肺外结核，及识别活动性结核感染，有可能提示NTM活动。