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摘要本文主要从以下几部分进行探讨：<br>　　第一部分 Linc-RAM基因表达调控机制及其在骨骼肌干细胞自我更新与分化中的功能<br>　　骨骼肌干细胞，也被称为肌卫星细胞(Satellite cells，SCs)，是位于成体骨骼肌组织的肌纤维膜和基底膜之间保持干性的单核细胞，在骨骼肌生长发育及出生后骨骼肌损伤—再生过程中发挥重要作用。正常情况下，骨骼肌成体干细胞处于静息状态，当受到外界刺激或损伤时，静息的骨骼肌干细胞被激活、增殖、分化参与修复损伤的肌纤维，同时少部分群体进行自我更新维持干细胞库的稳态并长期保持损伤再生的潜能。骨骼肌成体干细胞自我更新或分化异常是许多肌肉相关疾病的致病因素之一，如肌营养不良患者的骨骼肌成体干细胞存在严重的自我更新与分化缺陷。<br>　　近年来，人们对骨骼肌成体干细胞自我更新与分化调控机制的研究逐渐深入，并鉴定出多种参与调节SCs的自我更新与分化的调控因子。例如，广泛用于SCs体外培养的FGF2，尽管有研究表明FGF2通过抑制MyoD的转录调节骨骼肌干细胞自我更新、抑制干细胞分化，但我们对FGF2信号通路调控干细胞自我更新过程中涉及的下游靶基因仍然知之甚少。<br>　　长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类长度大于200 nt不编码蛋白的RNA，在细胞命运决定、增殖、分化、凋亡和衰老过程中发挥重要的作用。目前研究发现一些lncRNAs参与调控骨骼肌发育、骨骼肌细胞的增殖和分化。LincRNA Activator ofMyogenesis(Linc-RAM)是我们实验室首先发现和鉴定到的受MyoD调节，在骨骼肌细胞谱系特异表达的基因间区长非编码RNA。Linc-RAM基因通过促进MyoD/Baf60c/Brg1复合物的组装增强骨骼肌细胞分化。敲除小鼠的研究表明，Linc-RAM影响骨骼肌发育与再生。然而，目前对Linc-RAM在骨骼肌细胞中表达调控的分子机制以及Linc-RAM是否参与骨骼肌成体干细胞的自我更新与分化过程还不清楚。<br>　　本研究的核心科学问题是Linc-RAM基因的自身表达调控机制及其在骨骼肌成体干细胞自我更新与分化中的功能。我们的结果表明:在骨骼肌细胞中，Linc-RAM基因的表达受到FGF2信号通路调节，并在介导FGF2调控骨骼肌干细胞自我更新和分化的功能上发挥重要作用。实验室已有数据证明Linc-RAM基因表达受到FGF2/Ras/Raf/Mek/Erk1/2信号通路的负性调节。我们的结果进一步证明，在C2C12细胞中过表达MyoD能够拯救FGF2对Linc-RAM基因表达的抑制，同时从MyoD-/-;Pax7-nGFP小鼠分离骨骼肌干细胞研究发现，敲除MyoD基因后消除FGF2对Linc-RAM基因表达的抑制作用，由此说明成肌细胞转录因子MyoD在FGF2对Linc-RAM基因调节的过程中发挥重要作用。功能研究发现，在C2C12细胞中过表达Linc-RAM能够拯救FGF2对肌细胞分化的抑制，从Linc-RAM基因敲除的小鼠(Linc-RAM-/-;P ax7-nGFP)中分离骨骼肌干细胞，对其增殖和分化能力检测发现，Linc-RAM敲除后骨骼肌干细胞的分化能力减弱，而增殖能力增强。分离Linc-RAM基因敲除小鼠的单根肌纤维进行体外培养发现，Linc-RAM基因敲除后骨骼肌干细胞的分化能力减弱，自我更新能力增强。在人类DMD疾病模型Mdx小鼠中敲除Linc-RAM可以显著地改善Mdx小鼠的病理表型。<br>　　综上所述，本研究揭示了骨骼肌特异性表达的长非编码Linc-RAM基因受FGF2信号通路负性调节的分子机制，并介导FGF2调节骨骼肌干细胞自我更新与分化功能，从而为长非编码RNA的转录调控机制提供可靠依据，为Linc-RAM基因实现骨骼肌干细胞应用与临床治疗方面提供理论基础。<br>　　第二部分 miR-30e在骨骼肌中受myostatin负性调节参与肌纤维类型形成<br>　　Myostatin(MSTN)通过调节microRNAs(miRNA)负性调节肌细胞增殖分化。最近，我们以MSTN敲除(MSTN-/-)小鼠为模型，对骨骼肌进行miRNA微矩阵分析发现miR-431受MSTN信号通路调节。为进一步鉴定其他受MSTN调节的miRNAs，我们重新分析了这些miRNA芯片，并用RT-PCR方法进行验证。最终，我们发现与野生型小鼠相比，MSTN-/-小鼠骨骼肌中miR-30e显著上调。重要的是，miR-30e的预测靶基因能够参与肌细胞分化和肌纤维形成。利用荧光素酶报告基因法，我们进一步证明过氧化物酶增殖因子活化受体γ共激活子1α(Pgc1α)是miR-30e的直接靶基因。在C2C12中过表达miR-30e显著下调Pgc1α同时增加肌球蛋白重链Ⅱ基因的表达，由此说明miR-30e与糖酵解纤维形成有关。综上所述，我们的实验结果揭示了MSTN-/-小鼠中肌纤维类型的改变与miR-30e失调有关。