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摘要目的:<br>　　蛛网膜下腔出血(Subarachnoid Hemorrage，SAH))是神经外科较为常见的一类出血性脑卒中疾病，系指由于各种原因所导致的血液进入蛛网膜下腔而引起的一组临床症候群。通常将其分为原发性和继发性两类，原发性SAH主要是指颅底或脑组织表面血管破裂，血液直接进入蛛网膜下腔;继发性SAH则是由于脑实质出血后血液穿破脑组织进入蛛网膜下腔。按病因学进行统计，颅内动脉瘤(Intracranial Aneurysm)破裂引起的SAH占整个病例总数的绝大多数，约合50％～85％。而伴随人们健康意识的不断增强、神经影像学技术的不断发展，未破裂颅内动脉瘤的检出率逐年提高，并且得益于神经血管内介入技术的长足进步，未破裂颅内动脉瘤目前已经能够得到妥善的处理，对患者的生存质量及预期寿命几乎不会造成任何负面的影响。然而，一旦颅内动脉瘤破裂诱发SAH，将给患者带来灾难性的打击，据不完全统计，动脉瘤性蛛网膜下腔出血（Aneurysmal S ubarachnoid Hemorrhage，aSAH）发病后约有1/3的患者在接受医疗救助之前即发生院前死亡，1/3的患者入院后一周内死亡或遗留严重的神经功能并发症，仅存1/3的患者经过综合治疗后可以获得相对较好的临床预后，给社会和家庭带来沉重的负担和极大的痛苦。同时不难看出，相对于颅内动脉瘤本身已经能够通过外科手术或血管介入手段进行根治，其所诱发的SAH已然成为目前临床治疗难以突破的瓶颈所在，因此，如何有效的降低SAH患者的致死致残率并提高其远期生存治疗已成为该领域研究的热点和难点。<br>　　有鉴于此，研究者提出了EBI的概念，即在动脉瘤破裂后72小时之内发生的由活性氧、皮层播散性去极化、兴奋性氨基酸毒性、免疫炎症细胞、炎性介质等诸多因素相互交织形成的病理损伤网络。该理论的核心是认为自动脉瘤破裂出血开始，其对中枢神经系统的损伤也随即发生，并在随后的72小时内产生级联效应最终导致严重的病理性损害，继而认为EBI是导致SAH灾难性后果的最重要因素，针对EBI及时有效的干预，阻断损伤网络的形成，是改善SAH临床预后的关键所在。<br>　　因此，无论是中枢神经系统肿瘤、炎症、外伤或是卒中，神经元的保护一直是外科手术和内科治疗的核心。但是，非常遗憾的是，近年来所采取的单一针对神经元保护治疗的临床性实验均宣告失败。造成这种结果的原因主要有两点:一、将神经元从复杂的神经细胞广泛联系的网络中抽离和孤立出来，忽视了中枢神经自身的稳态对神经元细胞存活和生理功能的不可或缺;二、受限于传统的病理学观点，片面的看待和理解细胞死亡。关于前者，研究者已经逐步认识到其局限性，并提出了血管神经网络(Vascular Neural Network)等概念，由对神经元的单一保护向对中枢神经系统整体保护转移。对于后者，受益于细胞生物学近年来对细胞死亡的机制的深入探索和发现，使我们能够对神经元死亡有更加全面和深入的认识。<br>　　细胞生物学家于数十年前就发现肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor Alpha，TNF-α)与真核生物体内广泛存在的肿瘤坏死因子受体(Tumor Necrosis Factor Receptor,TNFR)结合后可以根据细胞所处环境和自身状态诱导细胞存活、凋亡或坏死。目前研究已证实，TNF-α通过激活核转录因子(Nuclear Factor Kappa B，NFκB)发挥促存活作用，或通过剪切激活半胱天冬酶-3（Caspase-3）导致细胞凋亡，且二者的具体信号激活转导机制和分子作用已基本清楚，唯独坏死由于其不可调控性，其具体发生机制被人们所忽视，长期以来停滞不前。2005年，美国哈佛医学院的袁钧英教授利用化学小分子文库从15，000余种化合物中筛选到一种小分子药物，能够抑制由TNF-α所诱导的细胞坏死，将其命名为“Necro statin-1”（nec-1），同时将能够被nec-1所抑制的具备坏死形态学特征的细胞死亡命名为坏死性凋亡(Necroptosis)。<br>　　综上所述，本研究旨在明确SAH后坏死性凋亡现象，并针对该通路相关信号因子进行干预，观察其在SAH损伤中的病理损伤作用，检验其潜在应用价值并寻找可供临床转化的干预靶点，丰富和拓展相关损伤机制学说，以期为临床SAH治疗提供更为有效的方法和策略。<br>　　材料与方法:<br>　　1、利用颈内动脉尼龙线穿刺法构建C57BL/6J小鼠SAH模型;<br>　　2、利用RIP3基因敲除、MLKL基因敲除、Ppif基因敲除及野生型C57BL/6J背景小鼠比较SAH后24小时及或72小时神经功能、脑含水量、神经元坏死、炎性因子表达、脑脊液细胞内代谢酶水平、胶质细胞活化水平;30天动物生存率、海马组织损伤萎缩程度;<br>　　3、体外原代培养E17.5 C57BL/6J胎鼠海马神经元，分别给予TNF-α、z-VAD-fmk、Smac mimetics、自体血、氧合血红蛋白、FeCl2、FeCl3不同试剂进行干预，筛选原代海马神经元坏死性凋亡细胞诱导模型，检测其RIP3、MLKL蛋白表达水平、细胞死亡率和乳酸脱氢酶释放水平;<br>　　4、利用亚细胞器抽提、线粒体内外膜分离技术，观察MLKL激活后的变化分布规律;<br>　　5、利用免疫共沉淀技术观察MLKL与CypD的相互结合并通过影响线粒体通透性转化孔功能导致线粒体功能崩溃，进一步了解MLKL与CypD在蛋白修饰水平上的相互作用和影响。<br>　　结果:<br>　　1、首次观察到SAH后24小时小鼠海马齿状回区大量颗粒神经元出现坏死，并明确其死亡类型为坏死性凋亡;海马CA1区、CA3区神经元受累较轻;与颅底血肿直接接触的底面脑皮层神经元则对坏死性凋亡不敏感。敲除坏死性凋亡关键上游调控蛋白RIP3可阻止齿状回颗粒神经元大范围死亡，能够在近期显著改善SAH动物脑水肿程度、神经功能评分，远期显著减轻海马萎缩程度及降低动物死亡率。结果提示:首次实验证实坏死性凋亡在SAH后发挥重要的致损伤作用，且SAH诱导的坏死性凋亡具有明显的区域特异性和细胞特异性。<br>　　2、原代培养的小鼠海马神经元对氧合血红蛋白刺激表现出高度致坏死性凋亡敏感性;对TNF-α+z-VAD-fmk+Smac mimetics(TZS)联合用药表现出中度致死敏感性;对自体血、FeCl2、FeCl3低度敏感或不敏感。TZS或氧合血红蛋白刺激后，细胞RIP3和MLKL蛋白表达量显著升高并伴随大量细胞死亡，RIP3敲除后可以发挥显著的保护作用。结果证实:经典的致坏死性凋亡细胞模型刺激可导致原代海马神经元死亡，氧合血红蛋白刺激较之可发挥更强的致死作用，抑制坏死性凋亡相关蛋白可发挥显著的保护作用。<br>　　3、SAH后RIP3下游相关蛋白MLKL、GLUD、GLUL、PYGL、ox-CaMKⅡ显著上调，但MLKL为主要致伤因子;SAH后RIP3介导MLKL向线粒体内外膜转位并导致线粒体ROS大量产生、钙缓冲能力下降、ATP耗竭、膜电位丧失，最终导致线粒体功能崩溃，而进一步实验发现SAH后MLKL向线粒体外膜、内膜转位并与线粒体通透性转化孔(Mitochondrial Permeable Transition Pore，mPTP)结构蛋白CypD结合而与另两种结构蛋白VDAC1及ANT无明显相互作用。结果提示:SAH后坏死性凋亡主要效应蛋白为MLKL，MLKL通过线粒体膜转位并与CypD相互作用导致线粒体功能崩溃导致细胞死亡。<br>　　4、SAH条件下，CypD转录水平无明显变化，但因其泛素化降解过程受抑导致蛋白含量显增加，同时CypD的乙酰化修饰水平明显增强使之肽酰-脯氨酰-顺反式异构酶(Peptidylprolyl Isomerase，PPIase)活性显著上调，伴随CypD与ANT的结合增加，RIP3或MLKL敲除并不影响CypD的乙酰化和泛素化水平，但却能减少CypD与ANT的结合。结果提示:SAH后CypD泛素化水平下调以减少蛋白降解，乙酰化水平上调以增加PPIase活性，RIP3及MLKL对此过程无明显影响，但MLKL向线粒体内膜转位后导致CypD和ANT结合增加，导致mPTP开放并最终使线粒体功能崩溃。<br>　　5、RIP3、MLKL、CypD基因敲除小鼠相较于野生型小鼠能够在SAH后30d不同程度减轻海马萎缩程度，改善小鼠空间学习及记忆能力，降低死亡率。此外，临床SAH患者脑组织样本CypD、p-RIP1、RIP1、p-RIP3、RIP3、p-MLKL及MLKL水平显著升高。结果提示:无论是实验性SAH动物还是临床SAH患者，坏死性凋亡在此损伤过程中发挥了极为重要的作用，预示针对坏死性凋亡的治疗可能开辟一条全新的SAH治疗策略，具有令人期待的向临床转化的应用价值。<br>　　结论:<br>　　1、首次系统而详细的观察到SAH后海马区神经元发生了广泛而严重的坏死性凋亡，其发生发展对疾病的近期演变和远期预后都具有显著的病理意义。<br>　　2、氧合血红蛋白可诱导体外培养的原代海马神经元发生坏死性凋亡，提示SAH后溢入蛛网膜下腔的红细胞崩解释放的氧合血红蛋白可能是重要的损伤介质。<br>　　3、SAH后的坏死性凋亡主要通过RIP1-RIP3-MLKL信号通路激活和执行，MLKL通过向线粒体转位发挥损伤致神经元死亡作用。<br>　　4、首次实验证实CypD通过与MLKL相互作用，共同促进mPTP开放，致线粒体功能崩溃进而神经元死亡。<br>　　5、提出既往被忽视的针对坏死神经元的保护可能成为SAH今后治疗的重要策略。