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摘要本项目拟选ZDF大鼠作为DM大鼠模型，并利用HSP27特异性磷酸化抗体，检测DBD逼尿肌HSP27表达及磷酸化水平的改变;以及调节HSP27磷酸化后离体逼尿肌条收缩相关功能的变化，初步验证HSP27对DBD后逼尿肌收缩功能的影响;为了明确HSP27的表达及磷酸化与CaD、TM等相关收缩蛋白之间的相互作用在DBD的关系，通过调节体外培养逼尿肌细胞中HSP27的磷酸化水平改变（基因转染）后检测HSP27与CaD、TM的共表达变化;激光共聚焦检测磷酸化HSP27与CaD等收缩相关蛋白的相互定位关系，探讨其在稳定肌动蛋白结构、调节平滑肌收缩中的作用机制。<br>　　研究一 调节HSP27磷酸化改变糖尿病大鼠的膀胱收缩功能的研究<br>　　目的：<br>　　研究正常大鼠与ZDF(zucker diabetic fatty)糖尿病大鼠膀胱收缩功能的差异，超微结构差异。<br>　　方法：<br>　　将2月龄ZDF雄性大鼠DM组(n=20)高糖高脂饲养，将2月龄SD雄性大鼠对照组(n=20)正常饮食条件下饲养，16周后检测大鼠的空腹血糖，行尿动力学检测（膀胱残余尿量、最大膀胱容量、最大膀胱压力）;透射电镜检测DM组与对照组膀胱逼尿肌组织超微结构改变情况;用HSP27磷酸化p38MAPK途径的特异性抑制剂和激动剂SB203580(C21H16FN3OS)和Anisomysin(ab120495C14H19NO4)预处理肌条，分别检测HSP27去磷酸化或过磷酸化对肌条收缩力和收缩频率的影响。<br>　　结果：<br>　　DM组膀胱收缩功能和逼尿肌牵张力低于SD组大鼠，糖尿病大鼠膀胱逼尿肌超微结构发生明显退行性变化。DM组牵张力显著低于SD组;HSP27磷酸化途径特异性的抑制剂SB203580刺激肌条后DM组及SD组肌条牵张力降低;HSP27磷酸化途径特异性的激动剂Anisomysin刺激后DM组及SD组肌条收缩力升高。SD组抑制后牵张力与未经处理DM组无显著差异;DM组抑制后与未经处理DM组无显著差异;DM组激动后牵张力与未经处理SD组无显著差异。<br>　　结论：<br>　　1.DBD膀胱收缩力显著降低ZDF糖尿病雄性大鼠是理想的2型糖尿病研究动物模型，血糖明显高于正常大鼠，膀胱逼尿肌最大排尿压力显著低于正常大鼠。<br>　　2.DBD膀胱结构退化用电子显微镜检测逼尿肌超微结构与对照相比，糖尿病组ZDF大鼠的逼尿肌细胞肥厚、肿胀，细胞内肌丝减少和萎缩。<br>　　3.DBD的逼尿肌牵张力明显低于正常组，趋势与膀胱排尿压一致。<br>　　4.DBD中HSP27磷酸化起重要的调节作用：针对正常组，下调其HSP27的磷酸化水平，牵张力可降低到与糖尿病组相近;针对糖尿病组，上调其HSP27的磷酸化水平，牵张力可接近正常组;而下调其HSP27的磷酸化水平，牵张力无更明显降低。<br>　　研究二 高糖对大鼠逼尿肌组织及细胞的HSP27及磷酸化水平CaD、TM的表达影响及机制研究<br>　　目的:<br>　　研究糖尿病膀胱组织HSP27及其磷酸化位点Ser15、Ser78、Ser82以及CaD、TM的表达差异;不同浓度葡萄糖是否对逼尿肌细胞HSP27及磷酸化水平表达和相关收缩蛋白CaD、TM的表达有影响;3 D-HSP27和3G-HSP27经慢病毒转染逼尿肌细胞后是否对HSP27及相关收缩蛋白CaD、TM的表达有影响。<br>　　方法:<br>　　利用免疫荧光染色，组织学检测DM组与对照组膀胱HSP27和CaD、TM的表达与分布情况;用QRT-PCR和Western-blot的方法检测DM膀胱及对照组膀胱中HSP27的转录和表达水平差异。利用特异性的磷酸化抗体标记检测HSP27 Ser15、Ser78和Ser82的磷酸化水平变化。 用QRT-PCR和Western-blot的方法检测DM膀胱及对照组膀胱中CaD、TM等相关收缩蛋白的转录和表达水平差异。SD大鼠断颈处死，超净工作台内开腹，取出膀胱，去黏膜层并剪碎后移入10ml 0.1％胶原酶P消化液的离心管中，37。C孵育45min到1h，漂洗后细胞悬液重悬于含10％FBS的DMEM培养基中;培养基中正常葡萄糖浓度(5mM)为对照组，高葡萄糖浓度(50mM)为干预组，通过免疫荧光染色和westernblot检测48h后HSP27在逼尿肌细胞表达和磷酸化水平，通过QRT-PCR和Western-blot的方法检测逼尿肌细胞中CaD、TM的转录和表达水平差异。构建、纯化LV5-3 G-HSP27和LV5-3D-HSP27过表达慢病毒包装，通过LV5-3G-HSP27 homo、LV5-3D-HSP27 homo及LV5 NC阴性对照病慢毒载体系统转染逼尿肌细胞。细胞在静息状态或0.1uM乙酰胆碱刺激后，收集体外培养的逼尿肌细胞裂解后提取细胞蛋白，然后通过免疫共沉淀和免疫印迹技术分析磷酸化的HSP27与收缩相关蛋白(CaD、TM)的结合能力。将pEYFP-HSP27分别和pECFP-CaD、pECFP-TM的质粒共转染膀胱逼尿肌细胞，培养48h后，激光共聚焦显微镜检测蛋白共定位情况。<br>　　结果:<br>　　膀胱组织中HSP27在糖尿病膀胱大鼠模型中表达下降，并且其三个磷酸化亚型(Ser15、Ser78和Ser82)均显著低于正常对照组;而CaD和TM显著高于正常对照组;高糖培养组的SD大鼠逼尿肌细胞数明显低于正常糖浓度。<br>　　逼尿肌细胞培养中，QRT-PCR检测高糖培养组CaD和TM在逼尿肌细胞的表达高于正常糖浓度组;免疫荧光检测HSP27在高糖培养组中表达下降，并且其三个磷酸化亚型（Ser15、Ser78和Ser82）均显著低于正常对照组;Western blot检测高糖组下HSP27在糖尿病膀胱大鼠模型中表达下降，并且其三个磷酸化亚型（Ser15、Ser78和Ser82）均显著低于正常对照组，而CaD和TM显著高于正常对照组。<br>　　LV5-3D-HSP27过表达慢病毒转染体外培养的膀胱平滑肌细胞，HSP27与CaD共沉淀增加，LV5-3G-HSP27过表达慢病毒转染体外培养的膀胱平滑肌细胞，HSP27与CaD共沉淀减少，HSP27和TM共沉淀呈阴性;激光共聚焦下pEYFP-HSP27和pECFP-CaD共转染组HSP27的分布与CaD分布共定位非常接近，pEYFP-HSP27和pECFP-TM共转染组HSP27的分布与TM分布无明显相关性。<br>　　结论:<br>　　1.HSP27及其磷酸化水平在糖尿病膀胱组织和体外高糖培养的逼尿肌细胞中表达、分布和转录水平降低，而CaD和TM平滑肌收缩相关蛋白表达和分布增高;其中HSP27磷酸化水平的下调使逼尿肌细胞结构失去稳定性，是糖尿病膀胱收缩功能降低的主要原因之一。<br>　　2.膀胱逼尿肌收缩机制之一可能为:磷酸化的HSP27增加了CaD与其的结合，并使之发生结构变异，释放出TM，结合肌动蛋白产生收缩;而糖尿病状态下，低磷酸化水平的HSP27结合CaD能力降低，CaD与TM更多的绑定在一起，而TM无法与肌动蛋白结合，使收缩力下降。<br>　　综上所述，我们在组织层面利用2型糖尿病ZDF雄性大鼠模型完成膀胱压力测试及对超微结构的观察，并揭示高糖中HSP27磷酸化表达下降使逼尿肌的收缩结构和收缩功能活性下调可能是DBD的发病机制。其中收缩力的下调可以通过HSP27磷酸化的抑制剂或激动剂所改变。<br>　　2型大鼠模型中将DBD与HSP27的磷酸化及相关收缩蛋白对平滑肌收缩功能的调节联系起来，来探寻DBD肌源性改变的趋势及其机制。<br>　　在细胞层面研究高糖对大鼠膀胱逼尿肌相关收缩蛋白及磷酸化转录和表达的影响。并揭示高糖下调了HSP27及其磷酸化水平，而上调了CaD和TM的表达。在通过过磷酸化的HSP27经慢病毒转染逼尿肌细胞发现HSP27磷酸化激活了CaD的磷酸化并与之结合，使被CaD绑定的TM释放而促进收缩的发生，从而解释了糖尿病的氧化应激从上游下调了HSP27磷酸化而上调了CaD，而CaD的活性也需要在磷酸化的HSP27激活下与HSP27结合发生结构变异才能释放TM，使肌肉收缩。故可以作出以下推测:①糖尿病导致HSP27和磷酸化的HSP27减少，这种下调导致CaD更多的与TM绑定而收缩功能下降;糖尿病导致氧化应激诱导了更多的CaD，而上调的CaD因为缺乏磷酸化HSP27的激活失去活性，导致其也绑定了更多的TM;这是DBD中HSP27参与调节的收缩功能降低的主要机制;②可能TM活性也需要磷酸化HSP27来激活，糖尿病诱导TM表达增多同时因为降低的磷酸化HSP27而减少了激活，也导致DBD中TM不能结合肌动蛋白实现调节收缩的活性。综上，糖尿病状态下，因为高血糖的影响，HSP27、磷酸化HSP27以及逼尿肌细肌丝收缩相关蛋白表达发生改变并均处于低活性状态，这使作用相当于骨骼肌中肌钙蛋白的这组平滑肌肌丝运动相关蛋白对收缩的开关调节功能难以保持在正常水平上。该推测揭示了DBD发生的肌源性相关的分子病理生理学机制。