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摘要目的：<br>　　探讨阻断C5a/C5aR治疗慢性移植物抗宿主病(cGVe)的疗效，为cGVHD的免疫治疗提供新的实验依据。<br>　　方法：<br>　　1.采集异基因造血干细胞移植后cGVHD患者、无cGVHD患者及供者静脉血标本，流式细胞术检测三组外周血淋巴细胞及CD14+单核细胞中C5aR的表达及CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞的比例，并进行相关性分析。<br>　　2.流式细胞术检测遗传背景相同的C5aR敲除及野生型BALB/c小鼠脾细胞中CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞占CD4+T细胞的比例;体外培养小鼠脾细胞，分为C5aR-/-组、野生型组、Rm C5a蛋白刺激组（分为100ng/mL及500ng/mL Rm C5a+野生型脾细胞两组），分别采用ELISA检测各组培养上清中TGF-β1的分泌水平及流式细胞术检测各组CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞的比例。<br>　　3.分选C5aR敲除及野生型BALB/c小鼠脾细胞中的CD4+T细胞，设C5aR-/-组及BALB/c组，通过CD3、CD28、IL-2、TGF-β1等细胞因子诱导Tregs细胞分化3天后，检测2组CD4+T细胞中CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞的比例。<br>　　4.建立小鼠cGVHD模型。通过移植主要组织相容性抗原(MHC)相合、次要组织相容性抗原(miHA)不合的异基因B10.D2雄性小鼠的骨髓细胞及脾脏细胞(8×106，1∶1)→BALB/c雌性小鼠，建立一种能模拟临床cGVHD的小鼠模型。<br>　　5.以cGVH小鼠模型为研究对象，设对照组及PMX53治疗组2组。随机分配cGVHD小鼠至PMX53治疗组及对照组，每组各6只，+29d时，所有小鼠均出现cGVHD，予PMX53（1mg/kg，每周2次，持续3周）治疗。治疗后临床观察：体重低于14g或到观察终点（移植后+65d）处死小鼠。观察终点进行以下实验：(1)观察2组小鼠cGVHD临床评分、生存时间及组织病理形态学改变。(2)流式细胞术检测两组小鼠脾细胞中C5aR的表达及脾脏CD4+T细胞中CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞的比例。(3)酶联免疫吸附试验(ELISA)检测2组小鼠外周血血浆中TGF-β1的分泌水平。<br>　　6.统计学分析：应用SPSS20.0软件对数据进行统计学分析。正态分布数据以均数±标准误((x)±SEM)表示。采用One-Way ANOVA比较多组间数据，采用Levene检验方差齐性;各组方差齐时，组间的比较选用可进行多个样本均数间两两均数比较的LSD。比较两组间数据，各组方差齐时，采用两样本t检验比较两组间均数。分析两变量之间的关系采用Spearman相关性分析，Kapplan-Meier法分析小鼠生存时间。检验水准均为：α=0.05。<br>　　结果：<br>　　1.cGVHD患者外周血淋巴细胞及CD14+单核细胞中C5aR的表达均显著高于无cGVHD患者及健康供者（淋巴细胞：3.76±0.30％vs2.36±0.55％，1.16±0.16％，P均＜0.001;CD14+单核细胞：94.05±0.52％vs89.51±0.40％，88.53±1.16％，P均＜0.001)，而CD4+T淋巴细胞中CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞的比例明显较无cGVHD患者及健康供者低（1.45±0.13％vs2.97±0.18％，3.16±0.31％，P均＜0.001），健康供者与无cGVHD患者间均无明显差异(P＞0.05);且CD4+T淋巴细胞中CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞的比例与淋巴细胞中C5aR的表达呈显著的负性相关(R=-0.603，P＜0.01)，而与CD14+单核细胞中C5aR的表达相关性分析无统计学差异(R=-0.378，P＞0.05)。<br>　　2.C5aR-/-促进Tregs细胞的分化，而Rm C5a抑制小鼠脾细胞TGF-β1的分泌及CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞比例：<br>　　(1)C5aR-/-组小鼠脾脏CD4+T细胞中Tregs细胞比例显著高于野生型小鼠(15.67±0.55vs11.3±0.60％,P＜0.01)。<br>　　(2)野生型组、100ng/mL及500ng/mL RmC5a蛋白刺激组与C5aR-/-组细胞培养上清中的TGF-β1分别为：879.17±27.42，322.67±25.33，413±217.29和1668±109.79);野生型组脾细胞培养上清中TGF-β1的分泌显著低于C5aR-/-组(P＜0.001)，但明显高于RmC5a蛋白刺激组(P＜0.01)，而100ng/mL与500ng/mLRmC5a蛋白刺激组间TGF-β1的表达无明显差异（P＞0.05）。<br>　　(3)流式检测显示100ng/mL及500ng/mL Rm C5a蛋白刺激组的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞在脾脏CD4+T细胞中的比例均显著低于BALB/c组及C5aR-/-组(P＜0.01)，且BALB/c组低于C5aR-/-组(6.91±0.30％vs9.76±0.33％，P＜0.001)：而100ng/mL与500ng/mL RmC5a蛋白刺激组对Treg细胞的表达无明显影响（5.59±0.08％vs5.80±0.03％，P＞0.05）。<br>　　(4)体外诱导CD4+T向Tregs细胞分化，发现C5aR-/-组Tregs细胞的比例显著高于BALB/c组（34.52±0.69％vs5.60±0.26％,P＜0.001）。<br>　　3.成功构建cGVHD小鼠模型，使用C5aR阻断剂PMX53治疗cGVHD小鼠：<br>　　(1)阻断C5aR改善cGVHD小鼠模型临床表现并延长小鼠生存时间。PMX53治疗组小鼠临床评分在治疗后逐渐减低，而cGVHD对照组小鼠临床评分持续加重;PMX53治疗组小鼠生存时间显著高于cGVHD对照组（P＜0.05）。<br>　　(2)阻断C5aR减轻cGVHD小鼠模型组织病理损伤。cGVHD对照组小鼠皮肤表皮层增生明显，真皮层大量胶原沉积，皮肤广泛炎症细胞浸润，皮下脂肪严重萎缩，毛囊数目明显减少;而PMX53治疗组小鼠显示出相对较轻的病理改变。cGVHD对照组肝脏HE染色显示炎性细胞浸润大部分门管区并伴淋巴细胞浸润胆管，而PMX53治疗组小鼠肝脏门管区较少受累。<br>　　(3)C5aR阻断剂PMX53下调C5aR表达，上调CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞比例。C5aR在PMX53治疗组小鼠脾细胞中的表达显著低于cGVHD对照组（1.36±0.96％vs3.41±0.29％，P＜0.05），而Tregs细胞比例却显著高于cGVHD对照组（10.56±0.40％vs13.64±0.48％，P＜0.001）。<br>　　(4)C5aR阻断剂PMX53促进TGF-31分泌。PMX53治疗组小鼠外周血上清中TGF-β1的表达显著高于cGVHD对照组（938.4±12.91vs745.6±24.48，P＜0.001）。<br>　　结论：<br>　　1、临床cGVHD患者C5aR高表达，CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例下降，阻断C5a/C5aR补体途径可能为cGVHD提供新的治疗靶点。<br>　　2、体外下调C5aR可介导TGF-β1的分泌增加，从而上调Tregs细胞的表达，反之，上调C5aR的表达，可介导TGF-β1分泌减少，从而下调Tregs细胞的表达。<br>　　3、cGVHD小鼠模型C5aR高表达，首次提出C5aR阻断剂PMX53可能通过促进TGF-β1分泌，促进CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞极化，减轻cGVHD的临床与病理学损伤，从而发挥抗cGVHD作用。