检索历史 清除

摘要Ca2+作为第二信使参与植物的生长发育等过程。在花粉管的极性生长过程中，花粉管顶端存在着一个Ca2+浓度梯度。Ca2+梯度被破坏以后，花粉管的生长受到抑制。花粉管顶端的Ca2+梯度的建立，主要由细胞内Ca2+库的释放和细胞质膜Ca2+通道介导的Ca2+内流引起的，其中后者起着主要的作用。拟南芥CNGCs家族被认为是候选的Ca2+通道，其中CNGC7、CNGC8、CNGC9、CNGC10、CNGC16和CNGC18在花粉管中高表达。本课题组最近的研究发现，CNGC18是控制拟南芥花粉粒萌发、花粉管极性生长和花粉管方向调控的关键花粉管顶端质膜Ca2+通道。但来自雌性生殖器官的引导信号分子如何通过调控CNGC18的活性来调控花粉管方向，目前还一无所知。针对这一科学问题，本论文通过蛋白质谱的方法，筛选和鉴定与CNGC18互作的蛋白，试图以此鉴定CNGC18上游调控因子。通过此方法获得了多个候选基因，进一步订购了52个感兴趣的拟南芥突变体，遗传学筛选的方式发现3个基因的突变体出现了育性下降的表型，gapc2是其中之一。在正常生理条件下，gapc2的拟南芥突变体植株的果荚相比于野生型小，解剖果荚发现果荚中的种子发育不正常，相比于正常种子数目减少，这暗示GAPC2可能为CNGC18上游的候选调控蛋白。选取GAPC2作为重点研究对象。<br>　　GAPC2属于糖降解过程中的一个关键的酶，它可以将甘油醛-3-磷酸转化成甘油醛1，3-二磷酸。GAPC2在拟南芥的根、叶、花中都有高表达，在花粉中也有高表达。酵母双杂交实验和免疫共沉淀实验证明CNGC18可以与GAPC2互作。在体外培养的条件下，gapc2-1和gapc2-2的花粉萌发率和花粉管的生长都受到影响。在花粉培养基中补加Ca2+可以部分回复花粉萌发率低和花粉管生长受抑制的表型。在gapc2-1和gapc2-2中花粉管的导向存在缺陷。并且在人胚肾上皮细胞HEK293T细胞中异源共表达CNGC18和GAPC2发现，GAPC2可以激活CNGC18的Ca2+通道活性。通过酵母双杂交实验，确定了GAPC2与CNGC18互作的必需氨基酸为CNGC18的N端的第42个位氨基酸。当CNGC18的N端第42个氨基酸天冬氨酸D被突变成赖氨酸K时，CNGC18-D42K不与GAPC2互作，GAPC2也不能激活CNGC18-D42K的Ca2+通道活性。CNGC18主要以异源多聚体的形式发挥功能，通过体内实验证实CNGC18-D42K通过影响CNGC18多聚体的形成来发挥功能。<br>　　本研究通过质谱实验找到一个与CNGC18互作的蛋白，它的拟南芥突变体植物表型与CNGC18有一定的类似性，并且对CNGC18和GAPC2互作的关键位点位点进行了分析，确定了CNGC18发挥功能的一个初步模型。