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摘要间皮素(Mesothelin，MSLN)是近年来发现的一种肿瘤分化抗原，分子量约40kDa，通过糖基磷脂酰肌醇锚定在细胞膜表面。其在正常组织有限表达，而在多种恶性肿瘤如恶性间皮瘤、胰腺癌、卵巢腺癌等中高表达，因此间皮素可作为肿瘤标志物用于肿瘤的诊断与治疗。间皮素的生物学功能目前仍不是很清楚，但已有多种靶向间皮素的治疗性抗体药物应用于临床研究中，如人鼠嵌合抗体(MORAb-009)、重组免疫毒素(SS1P，RG7787/LMB-100)、抗体药物偶联物(anetumab ravtansine)等。上述抗体药物的抗肿瘤活性主要是通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用或通过偶联免疫毒素发挥作用来实现，其抗肿瘤机制较为单一，且存在毒性及免疫原性较强等问题。<br>　　为了研发具有直接抗肿瘤活性且功能较齐全的微型抗体，基于全长抗体Fc段CH2结构域，开发出一类新型的单域抗体，即C-型单域抗体。相对于全长抗体IgG(约150kDa)，C-型单域抗体的分子量较小(约15kDa)，具有更好的组织渗透性和结合到存在位阻效应的抗原表位的能力。此外，经改造后的该C-型单域抗体可保持与Fc受体，如FcRn等的结合活性。在本实验室的前期研究中，基于改造的CH2突变噬菌体库(m3a1)筛选出靶向间皮素的C-型单域抗体2-F4，但其存在与间皮素的亲和力相对较弱、可溶表达量较低、对肿瘤细胞的抑制活性较差的问题。因此，本研究通过优化构建噬菌体表面展示突变文库的条件，进一步提高了突变文库的突变率和多样性，最终筛选到亲和力更高、且对肿瘤细胞具有直接抑制活性的候选抗体。<br>　　本研究利用易错PCR构建了基于m3a1的突变噬菌体展示文库，库容约为8×108，且突变率达80％。以纯化的间皮素和间皮素Fc融合蛋白为抗原，经过四轮筛选，初步鉴定出两个亲和力达到nM级别的候选克隆D3和F71。通过细胞免疫荧光，结果显示D3和F71均能特异识别锚定在细胞表面的间皮素（如卵巢腺癌细胞SK-OV-3等细胞表面的间皮素）;通过肿瘤细胞增殖抑制实验，发现D3对PANC-1（间皮素高表达的胰腺癌细胞）的增殖具有一定抑制作用，而F71效果不显著。为了初步检测两个候选抗体对肿瘤生长的抑制活性，本研究构建了裸鼠肿瘤模型，结果显示D3对PANC-1胰腺癌模型的肿瘤生长可能具有一定的抑制效果，并对裸鼠个体无明显毒性。D3和F71的理化性质分析表明，D3以单体的形式存在，具有良好的稳定性;而F71可能为二聚体，且易聚集，这可能是这两种抗体的生物学功能差异显著的原因。随后，通过生物分子相互作用仪测定出D3与间皮素Fc融合蛋白的亲和力高达2.2nM。通过ELISA看出D3可与MSLN的RegionⅠ和RegionⅢ相结合，该结果为后续的抗原表位鉴定及下游信号通路的研究提供了方向。综上所述，本研究初步筛选出与间皮素亲和力增强且对肿瘤具有抑制活性的候选抗体D3，其具有进一步开发成为新型治疗高表达间皮素肿瘤临床药物的潜力。