检索历史 清除

摘要研究背景:<br>　　肺癌已经发展成为了当今全球最为常见的恶性肿瘤之一，它严重侵害了人类的身体健康，并且其发病率和死亡率在近些年来均表现出了上升的趋势。肺癌按照组织病理类型划分为了非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)两大类，其中非小细胞肺癌病理类型占所有确诊肺癌的患者中的80％～85％，其余病理类型为小细胞肺癌。因为常见的早期肺癌通常没有典型的临床症状，而且多数易感人群并没有接受过定期的肺部体检，所以仅仅只有16％的患者在疾病的早期阶段被诊断，而大多数的肺癌患者错失了早期诊断的最佳时期。肺癌临床分期中的Ⅰ期和Ⅱ期非小细胞肺癌患者大多有机会接受手术治疗。然而，多数肺癌患者被确诊时，疾病往往已进展为Ⅲ或Ⅳ期，这些晚期肺癌患者中的绝大多数已经失去接受手术治疗的机会。尽管采用手术方式切除肿瘤病灶仍然是目前治疗肺癌的首选方式，但是为了增加手术切除的几率和减少复发转移，一部分拟接受手术的患者还需同时采用术前或术后辅助化疗方案。而绝大多数临床分期被划为Ⅲ期和Ⅳ期的非小细胞肺癌患者均需要接受化疗。对于这些需要化疗的肺癌患者来说，含铂的联合用药方案是目前临床公认的治疗中晚期非小细胞肺癌化疗一线方案。铂类药物中应用最广泛的是顺铂，但是在临床治疗中普遍存在着原发性和获得性的顺铂耐药现象，这严重削弱了顺铂对肿瘤细胞的杀伤效果。自从顺铂的耐药现象出现以来，广大研究者致力于探索顺铂耐药性产生的原因，并且提出了一系列有关顺铂耐药的分子生物学机制，研究发现顺铂耐药相关机制是由多因素、多分子共同参的复杂过程，主要包括了细胞凋亡通路的异常变化，DNA修复作用在细胞中的异常，药物在细胞中蓄积减少，药物去活作用增加，以及药物作用相关信号通路的调控异常等。但是到现在为止，在肿瘤治疗过程中出现的顺铂耐药现象依然没有得到解决，其具体的分子生物学机制尚未明确。因此，我们通过对肺癌顺铂耐药相关机制进行探索，进而找到逆转耐药现象的方法，这对克服化疗耐药有着重要的临床意义。<br>　　研究目的:<br>　　我们的研究通过非标记定量蛋白质组学质谱的方法在肺腺癌顺铂敏感细胞与耐顺铂细胞中筛选出一系列的差异蛋白，并选取其中特异性的Id4蛋白进行研究，明确其上游基因及下游信号通路。进一步探索Id4基因在肺鳞癌及大细胞肺癌中与顺铂敏感性的关系，从而为攻克非小细胞肺癌治疗中广泛存在的顺铂耐药现象提供新的分子生物学依据。<br>　　研究方法:<br>　　1.本研究通过非标记定量蛋白质谱组学技术对人肺腺癌细胞株和其亲本耐顺铂细胞株分别进行检测。筛选并分析两亲本细胞株中的差异蛋白及信号通路。并从中挑选出具有显著差异的Id4蛋白进行深度探索。<br>　　2.对蛋白质谱组学筛选出的Id4蛋白进行验证。我们应用Western blot技术验证Id4在两个亲本细胞株中蛋白水平的差异。应用Real-time PCR检测Id4在下游mRNA水平差异。<br>　　3.使用CCK8方法来测定肿瘤细胞对顺铂药物的敏感性。流式细胞技术检测两亲本肿瘤细胞在顺铂刺激下出现的凋亡率。<br>　　4.我们构建了Id4质粒，并将其转染入顺铂敏感细胞中。分别检测Id4表达升高后细胞耐药性、凋亡率和迁移能力的变化。以Id4基因序列作为模板，合成与能与Id4基因特异性结合的小干扰RNA。观察干扰Id4基因表达对细胞耐药性以及凋亡率的影响。<br>　　5.对蛋白质谱筛选结果进行深度分析。找出可能与Id4有关并参与顺铂耐药的相关信号通路。对可能参与耐药的信号通路进行验证.。<br>　　6.探索Id4在肺鳞癌和肺大细胞癌顺铂敏感性中产生的影响。分别在肺鳞癌H520细胞和肺大细胞癌H460细胞中转染Id4载体，观察上调Id4基因对两细胞顺铂敏感性和凋亡率的改变。进一步明确相关信号通路的改变。<br>　　研究结果:<br>　　1.通过Label-free非标记定量蛋白质组学技术对A549和A549/DDP细胞进行差异蛋白的检测，筛选出蛋白4140个，其中在A549中特有的蛋白886个，A549/DDP中特有的蛋白800个，A549和A549/DDP共有蛋白2586个，A549较A549/DDP表达上调蛋白718个，A549较A549/DDP表达下调蛋白281个。其中Id4蛋白在A549/DDP细胞中较A549细胞上调6倍。<br>　　2.验证蛋白质谱结果:A549/DDP细胞中Id4下游的mRNA量和蛋白表达水平明显高于A549敏感细胞株(P＜0.05)。耐顺铂细胞株的半数抑制浓度为16.64±1.15μg/ml，显著高与敏感细胞的1.67±1.23μg/ml(P＜0.01)。而耐顺铂细胞株的凋亡率为10.06±2.32％，明显少于A549细胞的20.13±2.85％(P＜0.05)。验证结果与质谱组学筛选出的差异结果相吻合。<br>　　3.在A549细胞中上调Id4基因可以增加肿瘤细胞对顺铂耐药性。在敏感细胞株中上调Id4基因后，发现Id4基因下游的mRNA水平以及蛋白表达量显著升高(P＜0.05，P＜0.05)、肿瘤细胞半数抑制浓度由2.02±0.45μg/ml上升至7.11±1.59μg/ml(P＜0.05)、凋亡率下降从19.49±2.45％下降到13.09±2.19％(P＜0.05)。然而上调Id4基因的表达对A549细胞的迁移及侵袭能力无影响(P＞0.05)。<br>　　4.A549/DDP细胞中的Id4基因被小干扰RNA沉默后可使肿瘤细胞对顺铂敏感性增加。在A549/DDP细胞中下调Id4基因后，Id4基因的下游的mRNA水平和蛋白表达量明显降低(P＜0.01，P＜0.05)、细胞半数抑制浓度由16.73±2.37μg/ml下降至9.31±1.86μg/ml(P＜0.05)、细胞凋亡率明显由10.21±2.35％升至15.61±2.44％(P＜0.05)。<br>　　5.A549/DDP细胞中磷酸化P38MAPK蛋白的表达量明显高于其亲本A549细胞(P＜0.05)。转染Id4质粒使A549细胞中磷酸化P38MAPK蛋白表达明显增高(P＜0.05)。当用小干扰RNA沉默Id4基因后，A549/DDP细胞中磷酸化P38MAPK蛋白表达量也随之下降(P＜0.05)。当P38MAPK通路被SB202190(P38MAPK抑制剂)抑制阻断后，A549/DDP细胞中磷酸化P38MAPK被抑制(P＜0.05)、IC50由16.64±1.15μg/ml下降到12.14±1.83μg/ml，(P＜0.05)、细胞凋亡率由(10.06±2.32)％升至（16.22±2.33）％，(P＜0.05)。上述结果提示Id4基因可以通过激活P38MAPK信号通路导致肺腺癌细胞产生顺铂耐药性，抑制P38MAPK信号通路可以部分逆转Id4基因导致的肺腺癌顺铂耐药。<br>　　6.探索上调Id4对肺鳞癌H520和肺大细胞癌H460顺铂敏感性的影响。转染Id4质粒使H460细胞的IC50由1.13±0.39μg/ml升至2.33±0.94μg/ml(P＜0.05)、凋亡率由14.21±2.07％下降到9.36±1.42％(P＜0.05)。但转染Id4质粒对H520细胞顺铂半数抑制浓度IC50和细胞凋亡率均无影响(P＞0.05)。结果提示上调Id4基因可以使肺大细胞癌H460细胞对顺铂敏感性降低并产生耐药。但Id4基因对肺鳞癌H520细胞的顺铂敏感性无影响。<br>　　7.研究上调Id4导致H460细胞对顺铂产生耐药机制，发现上调Id4使H460细胞中磷酸化的Stat3和p38MAPK蛋白表达量均升高。在上调Id4基因的H460细胞转染SB202190(P38MAPK抑制剂)后，IC50由2.33±0.64μg/ml下降到1.86±0.23μg/ml、凋亡率由9.36±1.42％升至10.65±3.89％(P＜0.05)。同样，在上调Id4基因的H460细胞转染WP1066（Stat3抑制剂）后，IC50由2.11±0.37μg/ml下降到1.59±0.21μg/ml，(P＜0.05)、细胞凋亡率从9.82±1.24％升至12.15±4.17％(P＜0.05)。研究结果提示Id4可能同时激活p38MAPK与Stat3信号通路来抑制顺铂诱导的凋亡过程，从而导致大细胞肺癌对顺铂耐药。抑制P38MAPK和Stat3信号通路可以部分逆转Id4基因导致的大细胞肺癌顺铂耐药现象。<br>　　研究结论:<br>　　Id4造成肺腺癌顺铂耐药的机制是其通过激活其下游P38MAPK信号通路，从而抑制肿瘤细胞凋亡的形成;上调Id4基因对肺鳞癌细胞的顺铂敏感性无影响;在大细胞肺癌中上调Id4基因能够激活Stat3和p38MAPK信号通路来抑制顺铂诱导的凋亡作用，从而产生顺铂耐药。我们对Id4基因的研究结果为探索非小细胞肺癌数顺铂耐药机制提供了新的线索。