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摘要目的:<br>　　心肌肥厚是一个多分子、多信号通路参与的复杂病理生理过程，可能导致心力衰竭、猝死等严重心血管事件，但是目前对于心肌肥厚发生发展的分子机制的认识仍十分有限。G蛋白信号通路调节蛋白(RGS)家族多个成员被发现参与心肌肥厚的病理生理过程。RGS12是分子量最大、功能结构域最多的RGS家族成员。结构的复杂性决定了RGS12可以发挥更复杂和更精密的分子调控作用。本研究旨在阐明RGS12对心肌肥厚的影响及其具体机制。<br>　　方法:<br>　　第一部分:选取野生型(WT)小鼠及Sprague-Dawley大鼠乳鼠心肌细胞作为研究对象，分别采用胸主动脉缩窄术(AB)和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)处理建立在体心肌肥厚和离体心肌细胞肥大模型，运用Western blot检测造模后各时间点心肌组织、心肌细胞和成纤维细胞内RGS12表达水平。<br>　　第二部分:选取全系统RGS12基因敲除(RGS12-KO)小鼠和WT小鼠作为研究对象，采用AB构建心肌肥厚模型。手术4周后检测相关指标:取材小鼠心脏、肺脏和左侧胫骨，计算心体比(HW/BW)、心胫比(HW/TL)和肺体比(LW/BW);采用H&E、WGA、PSR等病理染色评价心肌细胞横截面积及胶原沉积水平;超声成像仪检测小鼠心脏功能;应用实时定量PCR检测心肌肥厚和纤维化标志物水平。<br>　　第三部分:选取心脏特异性RGS12转基因（RGS12-CTG）小鼠和CAG-(loxP)CAT(loxP)-RGS12/α-MHC-MerCreMer双转基因(CRMC)小鼠作为研究对象，采用AB构建心肌肥厚模型。手术4周后检测相关指标:取材小鼠心脏、肺脏和左侧胫骨，计算HW/BW、HW/TL和LW/BW;采用H&E、WGA、PSR等病理染色评价心肌细胞横截面积及胶原沉积水平;超声成像仪检测小鼠心脏功能;应用实时定量PCR检测心肌肥厚和纤维化标志物水平。<br>　　第四部分:利用腺病毒转染手段，构建RGS12低表达(AdshRGS12)或高表达(AdRGS12)乳鼠心肌细胞，以腺病毒载体AdshRNA和AdGFP转染乳鼠心肌细胞作为相应的对照组，分别运用AngⅡ和内皮素(ET-1)构建离体心肌细胞肥大模型。促肥厚因子干预48小时后检测相关指标:采用免疫荧光染色比较测量心肌细胞表面积;应用实时定量PCR检测心肌肥厚标志物水平。<br>　　第五部分:分别在动物实验和细胞实验中，运用Western blot检测各组小鼠心脏组织或心肌细胞中MAPK信号通路分子的总量和磷酸化水平变化。然后，以Sprague-Dawley大鼠乳鼠心肌细胞为研究对象，采用AngⅡ干预构建离体心肌细胞肥大模型，运用免疫共沉淀检测RGS12与信号通路关键分子的相互作用。最后，以RGS12-TG和CRMC小鼠作为研究对象，采用AB构建心肌肥厚模型，使用信号通路分子特异性抑制干预小鼠。手术4周后检测相关指标:取材小鼠心脏、肺脏和左侧胫骨，计算HW/BW、HW/TL和LW/BW;采用H&E、WGA、PSR等病理染色评价心肌细胞横截面积及心肌纤维化程度;超声成像仪检测小鼠心脏功能。<br>　　结果:<br>　　第一部分:在体心肌肥厚模型和离体心肌细胞肥大模型中，心肌肥厚标志物表达水平明显升高。与假手术组(Sham)相比，AB组小鼠心肌组织内RGS12蛋白表达量明显提高，且手术8周后的表达水平高于手术4周后。与在体实验类似，AngⅡ干预24小时和48小时后，心肌细胞内RGS12的蛋白质水平逐渐升高。然而，AngⅡ干预后，成纤维细胞内RGS12蛋白水平无明显变化。<br>　　第二部分:WT和RGS12-KO小鼠行假手术造模后，两组小鼠的心脏大小、纤维化程度、心脏功能及相关基因表达水平无明显差异。AB构建心肌肥厚模型4周后，取材结果发现，RGS12-KO小鼠的HW/BW、HW/TL和LW/BW小于WT小鼠;病理染色结果发现，RGS12-KO小鼠的心脏大小、心肌细胞横截面积、间质和血管周围胶原沉积以及胶原容积低于WT小鼠;心脏超声结果发现，RGS12-KO小鼠的左心腔扩大和左心收缩功能减低程度好于WT小鼠;RT-PCR检测结果发现，RGS12-KO小鼠的心肌肥厚标志物的mRNA表达水平低于WT小鼠。<br>　　第三部分:CRMC和RGS12-CTG小鼠行假手术造模后，两组小鼠的心脏大小、纤维化程度、心脏功能及相关基因表达水平无明显差异。AB构建心肌肥厚模型4周后，取材结果发现，RGS12-CTG小鼠的HW/BW、HW/TL和LW/BW高于CRMC小鼠;病理染色结果发现，RGS12-CTG小鼠的心脏大小、心肌细胞横截面积、间质和血管周围胶原沉积以及胶原容积大于CRMC小鼠;心脏超声结果发现，RGS12-CTG小鼠的左心腔扩大和左心收缩功能减低程度较CRMC小鼠加重;RT-PCR检测结果发现，RGS12-CTG小鼠的心肌肥厚标志物的mRNA表达水平高于CRMC小鼠。<br>　　第四部分:PBS干预AdshRGS12、AdshRNA、AdRGS12和AdGFP组乳鼠心肌细胞48小时后，各组乳鼠心肌细胞表面积和相关基因表达水平无明显差异。AngⅡ干预48小时后，免疫荧光染色结果发现，AdshRGS12组心肌细胞表面积小于AdshRNA组，而AdRGS12组心肌细胞表面积大于AdGFP组;RT-PCR检测结果发现，AdshRGS12组心肌肥厚标志物的mRNA表达水平低于AdshRNA组，而AdRGS12组心肌肥厚标志物mRNA的表达水平高于AdGFP组。<br>　　第五部分:促肥厚刺激不影响丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路分子的蛋白质总量，却引起MAPK信号通路分子的磷酸化程度升高。其中，JNK1/2和P38的磷酸化程度不受RGS12表达水平的影响，而RGS12高表达提高MEK1/2和ERK1/2的磷酸化水平，RGS12低表达降低MEK1/2和ERK1/2的磷酸化水平。同时，AngⅡ干预后，RGS12能够在心肌细胞内与MEK1/2结合形成功能复合体。在RGS-CTG和CRMC小鼠心肌肥厚模型中，MEK1/2特异性抑制剂(U0126)干预能够显著降低小鼠的HW/BW、HW/TL和LW/BW，改善小鼠心肌肥厚、心肌细胞横截面积增大、间质和血管周围胶原沉积，缓解左心腔扩大和左心收缩功能减低。更为重要的是，这些心脏肥厚性重构指标在RGS-CTG/U0126和CRMC/U0126小鼠之间无明显统计学差异。<br>　　结论:<br>　　本研究结果表明促肥厚刺激诱导心肌细胞内RGS12表达升高，高表达的RGS12与MEK1/2形成功能复合体，促进MEK1/2-ERK1/2信号通路激活，促进压力负荷诱导的心肌肥厚发生发展。因此，RGS12具有成为临床治疗心肌肥厚新靶点的潜力。