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摘要目的：<br>　　本研究先检测miR-197及GAB2在胶质瘤组织中的表达水平，在人胶质瘤细胞系A172细胞中分别验证miR-197与GAB2的细胞功能，并探讨miR-197与GAB2是否具有相关性及相互作用，进一步检测两者可能的相互作用位点。<br>　　1、本研究选取人胶质瘤标本及对应扩大切除后脑组织，分别检测miR-197及GAB2的表达水平，进一步验证在胶质瘤中miR-197及GAB2表达水平。<br>　　2、培养胶质瘤A172细胞并传代，分别以pre-miR-197（miR-197前体）及GAB2质粒转染，并设相应对照，分别检测miR-197与GAB2在A172中的细胞功能，探讨在胶质瘤细胞中miR-197表达水平与GAB2的表达是否具有相关性及相互作用，阐明miR-197与GAB2的表达之间的调控与胶质瘤发生、发展等的关系。<br>　　3、预测并检测miR-197与GAB2可能的相互作用位点，探讨胶质瘤靶向治疗的新靶点的可行性，为胶质瘤治疗提供可能的新的治疗方法。<br>　　方法：<br>　　1、选取胶质瘤标本及对应扩大切除后脑组织;培养并传代A172细胞，分别以pre-miR-197及GAB2质粒转染;分别设对照miR转染及空载体质粒转染A172细胞作为对照。RT-qPCR验证pre-miR-197转染的效率，Western blot分析验证GAB2质粒转染效率。<br>　　2、以原位杂交法检测miR-197在胶质细胞瘤组织及其对应扩大切除后脑组织样本之间的表达差异。<br>　　3、pre-miR-197转染及对照miR转染的A172细胞，分别采用细胞计数分析、集落形成实验验证miR-197对A172细胞增殖及细胞集落形成的影响;细胞周期分析检测两组细胞之间细胞分期差异;BrdU掺入实验验证miR-197对A172细胞中DNA合成的影响;Western blot进一步验证A172细胞中，miR-197对增殖标记物的蛋白表达水平的影响。<br>　　4、随机选取部分胶质细胞瘤组织及扩大切除后脑组织，以Western blot法检测GAB2在两者之间的表达差异，免疫组化法检测GAB2在胶质瘤组织切片中的蛋白表达水平，并探讨与胶质瘤级别的相关性。以不同剂量(1nM、10nM、40nM)的表达GAB2质粒转染A172细胞，MTT法在不同时间点测定A172相对数量，推测GAB2与细胞增殖的相关性，以及是否与剂量相关。<br>　　结果：<br>　　1、RT-qPCR证实:与对照组中以对照miR转染相比，pre-miR-197转染的A172细胞中miR-197表达水平显著升高(P＜0.01)，说明pre-miR-197能高效转染A172细胞;Westem blot证明，与空载体质粒转染相比，表达GAB2的质粒显著提高了A172细胞中GAB2蛋白表达水平，表达GAB2的质粒能高效转染A172细胞。<br>　　2、原位杂交法分析显示，与对应扩大切除后脑组织样本相比，miR-197在胶质细胞瘤组织本标中表达水平被显著下调(p＜0.05)。<br>　　3、细胞计数实验显示，与未处理组或对照miR处理的对照组相比，在被pre-miR-197转染的A172细胞中，细胞活性比率在每一个时间点明显低于另外两组(P＜0.01)。细胞周期分析显示被pre-miR-197转染的A172细胞表现出较低的S期比例(p＜0.05);集落形成实验表明，在被pre-miR-197或对照miR转染的A172细胞中，大于50细胞的集落计数，两组之间存在显著差异(P＜0.01)，miR-197在A172细胞显著抑制集落形成;BrdU掺入实验显示pre-miR-197转染组与对照组中细胞中DNA的合成水平在24小时和48小时均存在显著差异(P＜0.05),pre-miR-197转染组明显低于对照组。与对照miR转染组相比，Western blot显示miR-197显著下调了PCNA，Rb，Ki67，CDK2，CDK4和E2F1的表达水平(p＜0.05)。<br>　　4、Western blot证实与对应扩大切除脑组织标本相比，GAB2在胶质细胞瘤组织及邻近对应扩大切除脑组织标本之间的表达存在明显差异(p＜0.05)，GAB2的表达水平在大多数胶质细胞瘤标本中较高。免疫组化法中检测到:胶质瘤级别分别为Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ级中的GAB2蛋白表达水平（++/+++）占百分比分别为23.68％、38.46％、59.09％和75.0％。GAB2在各级别胶质瘤中的表达水平差异有统计学意义(x2=24.053，P＜0.001)，胶质瘤分级越高，GAB2的表达水平越高:Ⅰ级vs.Ⅱ级(P＜0.05);Ⅱ级vs.Ⅱ级(P＜0.05);Ⅱ级vs.Ⅳ级(P＜0.05)。MTT法检测以不同剂量（1nM、10nM、40nM）的表达GAB2质粒转染的A172细胞数量存在明显差异，GAB2质粒剂量越大，A172细胞相对数量越多。<br>　　5、miR-197与GAB2的相互作用<br>　　(1)在被pre-miR-197和对照miR转染的A172两组细胞中，Western blot检测到GAB2蛋白表达水平在pre-miR-197转染组中显著下调(p＜0.05)。免疫荧光分析测定表明，GAB2抗体免疫荧光染色强度在两组之间存在显著差异(P＜0.01)，pre-miR-197转染组GAB2水平明显低于对照组。RT-qPCR证实在两组细胞中，GAB2mRNA表达水平无明显差异(P＞0.05)。<br>　　(2)以表达GAB2质粒和空载体质粒转染的A172两组细胞中，Northern blot分析显示miR-197表达水平在两组间存在明显差异(p＜0.05)，在GAB2质粒转染组明显低于空载质粒转染组，RT-qPCR证实miR-197表达水平在两组间有显著差异(P＜0.01)，在GAB2质粒转染组中明显下调。microRNA微阵列分析显示，miR-197表达水平在GAB2质粒转染组中表达水平明显减低。<br>　　(3)MTT法及BrdU分析结果共同证实:GAB2/Pre-miR-197及empty-Vector/Pre-miR-197组两组细胞中，A172细胞增殖活性有显著差异(P＜0.01)，GAB2/Pre-miR-197组明显高于empty-Vector/Pre-miR-197组;Pre-miR-197/GAB2及control-miR/GAB2两组A172细胞之间无显著差异(P＞0.05)。<br>　　6、miR-197在GAB2的靶向位点<br>　　(1)TargetScan程序预测miR-197靶向GAB2mRNA的3'-UTR共3个可能位点，分别位3885-3891、1151-1158、2044-2050。<br>　　(2)荧光素酶报告基因分析结果证实，荧光素酶报告以三个位点定向序列实施，构建Wild-type-GAB2-WT-luc-1（包含3885-3891位点）、GAB2-WT-luc-2（包含1151-1158位点）和GAB2-WT-luc-3（包含2044-2050位点）三种荧光素酶质粒。三种荧光素酶质粒分别引入pre-miR-197与对照miR分别转染的两组A172细胞细胞后，GAB2-WT-luc-1及GAB2-WT-luc-3荧光素酶活性在两组细胞中无显著差异差别(P＞0.05);而GAB2-WT-luc-2质粒荧光素酶活性在两组细胞中有明显差异(p＜0.05)，pre-miR-197转染组明显低于对照miR转染组。在使1151-1158位点中四个碱基突变后，构建GAB2-MUT-luc-2（突变型）质粒，GAB2-MUT-luc-2质粒引入两组细胞后，荧光素酶活性在两组中无明显差别(P＞0.05)。<br>　　(3)缺少预测的3'-UTR的GAB2质粒分别转染pre-miR-197与对照miR转染的两组A172细胞，Western blot分析检测两组细胞中，GAB2表达无明显差异(p＞0.05)。<br>　　结论：<br>　　1.miR-197的表达在胶质瘤细胞中被下调，miR-197在A172细胞中抑制了细胞的增殖。<br>　　2.在胶质瘤细胞中，GAB2表达被上调并且与胶质瘤级别呈正相关，在A172细胞中GAB2促进了细胞的增殖。<br>　　3.miR-197在胶质瘤组织细胞中的表达被GAB2显著抑制，在A172细胞中，pre-miR-197转染后造成的miR-197的过度表达下调了GAB2的表达;GAB2质粒转染后造成的GAB2的过度表达抑制了miR-197的表达，并进一步促进了细胞的增殖。<br>　　4.在A172细胞中，miR-197通过靶向GAB2mRNA的3'-UTR1151-1158位点，抑制GAB2蛋白表达，但GAB2rnRNA表达水平未受影响。<br>　　5.在胶质瘤治疗中，GAB2作为miR-197的靶蛋白，通过恢复或增加miR-197的表达，从而下调GAB2的表达，抑制肿瘤细胞的增殖，降低胶质瘤细胞的侵袭性，代表着大有前景的胶质瘤新的靶向治疗的方法。