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摘要小电导-Ca2+-激活K+通道(small-conductance Ca2+-activated K+channels，SK，KCa2)几乎存在于所有可兴奋细胞的胞浆膜上，依赖于细胞内的Ca2+进行激活。SK通道家族由SK1、SK2、SK3以及一个在结构和功能上与SK通道相似的中电导-Ca2+-激活K+通道(intermediate-conductance Ca2+-activated K+channels，IK或称SK4)组成。SK1、SK2和SK3三个亚型在人类、小鼠和大鼠心肌细胞中均有表达，参与心肌细胞动作电位复极化的构成。研究显示SK1和SK2主要表达在心房，而敲除SK2通道的动物出现心房细胞复极化延长，增加房颤和房扑等快速性心律失常的易感性。因此，SK2通道可能与室上性快速性心律失常有关，可作为室上性快速性心律失常的治疗靶点，但它的调控机制目前还不明确。<br>　　引起SK2通道开放的细胞内Ca2+信号来源有两条途径:位于细胞膜上的电压-门控Ca2+通道(voltage-gated Ca2+channels，VGCCs)及内/肌质网(endo/sarcoplasmic reticulum，ER/SR)膜上RyRs(ryanodine receptors)敏感的Ca2+释放通道。已有研究报道指出心肌细胞膜的Cav1.3L型Ca2+通道通过α-actinin与SK2通道进行耦联，实现对SK2通道的调控，这提示SK2通道可能不是直接和调控性的Ca2+通道有生理性相互作用。我们实验室前期实验证据已显示心肌细胞膜表面的SK2通道与SR RyR2受体通道有功能性耦联，但它们二者之间耦联的中间分子并不清楚。<br>　　本研究通过质谱分析和生物信息学的方法筛选心肌组织中与JP2相互作用的蛋白质，采用心肌组织和转染HEK293细胞进行免疫共沉淀和GST pull-down实验来验证JP2与SK2通道、JP2与RyR2之间的相互作用，进一步制备不同片段GST-JP2原核表达质粒来验证JP2与SK2通道和RyR2发生相互作用的结构域，并通过功能性实验检测JP2敲减后对钙瞬变(calcium transients)的影响，以及JP2敲减后心肌钙相关蛋白的表达。<br>　　研究方法:<br>　　1.采用健康成年C57BL/6小鼠，体重20-25g，雌雄不拘。<br>　　2.心肌肌质网小泡膜蛋白的分离和检测:用差速离心的方法提取成年C57BL/6小鼠心脏肌质网小泡的膜蛋白。并用Western blot方法检测膜蛋白中SK2、JP2和RyR2的蛋白，用心肌组织蛋白做阳性对照。<br>　　3.质谱分析:心肌肌质网小泡膜蛋白裂解液中加入JP2抗体或鼠源无关的抗-IgG抗体，再用proteinG-Sepharose捕获制备免疫共沉淀复合物，进行电泳后，考马斯亮蓝染色，选择有差异的目标蛋白条带作为质谱分析样品，送北京大学医学部进行质谱分析。<br>　　4.生物信息学:根据文献将蛋白质筛选，用geneontology网站进行分类，并在String网站上查出它们之间的相互作用。<br>　　5.Western blot鉴定:将制备的免疫共沉淀复合物进一步用特异性SK2和RyR2抗体进行检测。<br>　　6.构建原核表达载体:使用BamHⅠ和NotⅠ双酶切原核表达载体pGEX-4T-1，将JP2全长、氨基端片段JP2-N1(1-253)和JP2-N2(216-350)、羧基端片段JP2-C(340-696)插入，构建融合基因pGEX-4T-1-GST-JP2、pGEX-4T-1-GST-JP2-N1(aa1-253)、pGEX-4T-1-GST-JP2-N2(aa216-350)和pGEX-4T-1-GST-JP2-C(aa340-696)。并用双酶切和测序方法鉴定构建的重组质粒。<br>　　7.GST融合蛋白的原核表达和纯化:将已鉴定的GST、GST-JP2以及GST-JP2不同片段重组质粒分别转化宿主菌E.Coli BL21，用IPTG26℃过夜诱导表达靶蛋白，并用GST.BindTM树脂层析柱纯化融合蛋白。<br>　　8.构建pSK2-IRES-EGFP和pJP2-pCDNA-EGFP质粒，共转染HEK293细胞:以pCMV6-entry-SK2和pCDNA3.1-JP2为模板，制备pSK2-IRES-EGFP和pJP2-pCDNA-EGFP质粒，用双酶切和测序方法鉴定构建的质粒。按照LipofectamineTM2000说明书转染质粒。<br>　　9.GST pull-down分析:将结合了GST融合蛋白的层析柱中加入心脏裂解液或HEK293细胞裂解液，过夜孵育后用谷胱甘肽elution buffer洗脱，并用SK2或RyR2抗体进行检测。<br>　　10.Co-IP法检测体外JP2和SK2相互作用:将共转染SK2和JP质粒的HEK293细胞裂解液与抗体过夜孵育，再用proteinG-Sepharose制备免疫共沉淀复合物;再分别用抗SK2和抗JP2抗体进行检测。<br>　　11.尾静脉注射腺病毒:给健康成年C57BL/6小鼠尾静脉注射总量为1×109PFU的携带阴性对照siRNA(Ad-NC)或JP2-siRNA(Ad-siJP2)的腺病毒。注射后7天分离成年小鼠心肌细胞。<br>　　12Western blot的方法测定注射腺病毒成年小鼠心脏JP2蛋白表达，并检测对SK2通道蛋白表达的影响。<br>　　13.钙瞬变的测定:将Ad-NC和Ad-siJP2组成年小鼠心肌细胞悬液进行梯度复钙，并加入终浓度为2μM的Fura-2/AM，用1HZ场刺激诱发钙瞬变，采用IonOptix心肌细胞收缩及离子浓度同步测量系统测量钙瞬变，数据采用美国IonOptix公司的IonWizard6.6软件进行分析。<br>　　14.Western blot的方法测定RyR2、Cav.1.2、NCX、SERCA2钙处理相关蛋白的表达。<br>　　15.统计学分析:所有数据以均数±标准误表示，用SPSS11.0统计学软件进行分析。以配对t检验或单因素方差分析(one-way AN OVA)进行统计学处理。统计分析以P＜0.05为有显著性差异。<br>　　实验结果:<br>　　1.Western blot检测显示肌质网小泡膜蛋白中有SK2、JP2和RyR2三种蛋白的表达。<br>　　2.在心肌肌质网小泡膜蛋白中加入JP2抗体（免疫共沉淀实验组）或鼠源无关的抗-IgG抗体（阴性对照组）制备质谱分析样品，电泳后考马斯亮蓝染色，观察对照组和实验组的蛋白质泳带，选出13条差异目标条带。质谱分析后得到35013个与JP2可能有相互作用的蛋白质，最终筛选出90个相关的蛋白质，其中包括SK2和RyR2蛋白。通过信息分析学进一步对蛋白质进行分类，并测定它们之间的相互作用。<br>　　3.String网站预测结果显示JP2和RyR2两者的直系同源蛋白可以在其他物种中共表达，可以预测它们之间可能存在相互作用;由于目前只能同源模建出小鼠SK2的CaM区（序列为655-785），不能预测SK2和JP2之间是否有相互作用;但通过Western blot的方法用特异性SK2和RyR2抗体检测到肌质网小泡裂解液中JP2可以沉淀SK2和RyR2蛋白。<br>　　4.GST-JP2融合蛋白可以pull-down心肌组织裂解液中的SK2，提示GST-JP2与心肌中SK2有相互作用，并且这种相互作用主要发生在JP2氨基末端的MORN区，尤其是GST-JP2-N1(aa1-253)片段作用明显，而GST-JP2的羧基末端GST-JP2-C片段(aa340-696)可以和心肌组织裂解液中的RyR2结合;体外实验结果显示GST-JP2的MORN1区1-253片段可以和HEK293细胞裂解液中的SK2蛋白结合。<br>　　5.将HEK293细胞共转染SK2和JP2质粒，用特异性JP2或SK2抗体孵育细胞蛋白裂解液进行Co-IP实验，结果显示SK2可以共沉淀JP2，JP2可以和SK2结合，提示体外JP2和SK2之间可能有相互作用。<br>　　6.成年小鼠尾静脉注射阴性对照siRNA或JP2-siRNA的腺病毒，Western blot结果显示，与空白对照组(Ctrl-NT)和阴性对照组(Ad-NC)相比，Ad-siJP2组JP2表达减少到了47％和48％，而SK2通道蛋白表达无明显变化。<br>　　7.成年小鼠心肌细胞JP2敲减后，用IonOptix心肌细胞收缩及离子浓度同步测量系统测量钙瞬变，与Ad-NC相比，Ad-siJP2组钙瞬变的幅度显著减少，钙瞬变到达峰值50％的时间却显著增加，而细胞内静息Ca2+水平和钙瞬变衰减50％的时间没有显著变化。使用Caffine测量RyR2依赖性肌质网Ca2+储存水平，与阴性对照组相比，钙瞬变的幅度亦显著减少。因此，敲减成年小鼠心肌JP2的表达，会减少心肌肌质网Ca2+的释放。<br>　　8.用Western blot的方法检测成年小鼠心肌钙处理相关蛋白的表达，与阴性对照组相比，Ad-siJP2组心肌组织RyR2、Cav.1.2、NCX、SERCA2的表达无显著变化。<br>　　实验结论:<br>　　小鼠心肌组织JP2与SK2、JP2和RyR2蛋白有相互作用，JP2分别通过羧基末端连接RyR2，而通过氨基末端的MORN结构域连接SK2，从而实现三者的功能联系。