益生菌联合益生元防治小鼠非酒精性脂肪肝的作用及机制研究-论文-万方医学网

益生菌联合益生元防治小鼠非酒精性脂肪肝的作用及机制研究

收藏纠错

摘要随着生活水平提高，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)发病率不断上升，已成为全球性公共问题，是世界范围内成人和儿童最常见的肝脏疾病，严重影响人们健康和生活质量。NAFLD发病率虽高但是具体的发病机制尚未完全明了，且目前尚无有效的治疗方法。因此，迫切需要寻找防治NAFLD有效的方法和措施。 　　NAFLD患者常伴随有胰岛抵抗、糖尿病、肥胖以及心血管疾病等，但不是所有肥胖都会有NAFLD，肠道因素可能在NAFLD发生发展中起着重要作用。不管动物实验还是人群研究均发现NAFLD常伴有肠道菌群失调及肠粘膜屏障功能破坏。一旦肠粘膜屏障被破坏，肠道细菌及其产物通过肠肝轴进入肝脏并引起一系列免疫和炎症反应，进而导致NAFLD、肥胖、2型糖尿病等多种代谢性疾病，最终导致NAFLD的发成和发展。 　　肠屏障是机体抵御肠道有害物质进入机体循环的第一道防线，肠粘膜屏障完整性对维持肠道功能以至于稳定的内环境十分重要。而肠上皮细胞紧密连接是维持肠屏障功能完整性的主要保障，是细胞通透性的主要决定因素。当肠道紧密连接蛋白表达异常可引起肠粘膜通透性增加，破坏了肠粘膜上皮细胞屏障的完整性，使肠粘膜屏障功能被破坏，肠道细菌及其产物可以透过肠道大量进入机体循环，引起NAFLD的发生发展。因此，防止肠道紧密连接蛋白表达异常，维持肠粘膜屏障的完整性，减少肠道细菌及其产物进入机体循环可能是NAFLD一个重要的防治措施。 　　已有研究证实益生菌能通过调节肠道菌群组成改善肠粘膜通透性减少高脂饮食诱导的代谢综合征发病。并且益生菌能够通过抑制脂肪在肝脏的积累，抑制肝脏炎症反应、胰岛素抵抗等延缓NAFLD的发生发展。低聚果糖是一种不能被人体直接消化吸收的水溶性膳食纤维，能够促进肠道拟杆菌属、乳杆菌属增殖。它能够调节脂肪生成酶基因的表达，减少肝脏脂肪酸源头合成，进而导致肝脏甘油三酯的减少，并且能够减少肝脏脂肪含量，降低血清胆固醇水平。 　　虽然有研究已经证实益生菌、低聚果糖均具有改善血脂、防治NAFLD的作用，但是副干酪乳杆菌N1115是否具有防治NAFLD的作用尚未见报道，而副干酪乳杆菌N1115联合低聚果糖对NAFLD的作用也未知。综上所述，假设副干酪乳杆菌N1115联合低聚果糖可以更好的改善NAFLD，其机制可能与调节肠粘膜屏障完整性有关。为了验证此假设，拟使用副干酪乳杆菌N1115联合低聚果糖对高脂饮食诱导的NAFLD小鼠进行干预，检测相关指标，验证干预效果。 　　第一部分副干酪乳杆菌N1115联合低聚果糖对高脂饮食诱导小鼠非酒精性脂肪肝的影响 　　目的: 　　通过使用副干酪乳杆菌N1115联合低聚果糖干预NAFLD小鼠，分析其对NAFLD小鼠血脂、血糖、肝脏脂肪沉积的作用，明确副干酪乳杆菌N1115、低聚果糖是否具有降脂、改善胰岛素抵抗及防治NAFLD的作用。 　　方法: 　　1.C57小鼠按正常饮食(ND)，高脂饮食(HFD)，高脂饮食+副干酪乳杆菌N1115(2.2×109CFU/mL)(HFD+L)，高脂饮食+低聚果糖(4g/kg)(HFD+FOS)，高脂饮食+副干酪乳杆菌N1115+低聚果糖(HFD+L+FOS)随机分为5组，所有实验组小鼠连续干预16周后摘眼球取血，脱臼处死。 　　2.实验过程评估各实验组小鼠一般状况、体重变化情况，实验结束时测量小鼠身长计算Lee's指数、称量小鼠肝重计算肝指数。 　　3.对各实验组小鼠血脂、血糖水平、胰岛素抵抗情况进行检测，通过HE染色和苏丹Ⅲ染色观察各组小鼠肝脏病理学改变。 　　结果: 　　1.连续16周给予C57小鼠高脂饮食，成功建立了C57小鼠非酒精性脂肪肝模型。 　　2.各实验组小鼠生命体征稳定，与其余各实验组相比，高脂饮食组小鼠最终体重、Lee's指数及肝指数均显著增加（P＜0.05），通过副干酪乳杆菌N1115、低聚果糖以及副干酪乳杆菌N1115+低聚果糖二者联合应用，均可以显著减少高脂饮食导致的小鼠的体重、Lee's指数及肝指数的增加(P＜0.05)。 　　3.高脂饮食组小鼠血清胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、血糖、胰岛素抵抗情况较其余各实验组均显著升高(P＜0.05)，同时显著降低了血清HDL水平(P＜0.05)，对肝脏组织进行HE和苏丹Ⅲ染色，显微镜下可见HFD组小鼠肝脏有明显脂肪变性和炎症细胞浸润。使用副干酪乳杆菌N1115、低聚果糖以及二者联合应用干预后，均能显著降低血清胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、血糖和胰岛素抵抗状态，增加血清HDL水平(P＜0.05)，并不同程度改善了肝脏脂肪变性以及炎症细胞浸润程度。 　　结论: 　　副干酪乳杆菌N1115和低聚果糖可以降低高脂饮食诱导的C57小鼠血脂、血糖、胰岛素抵抗水平，防治高脂饮食诱导的C57小鼠NAFLD，而且二者联合应用效果最显著。 　　第二部分副干酪乳杆菌N1115联合低聚果糖减轻小鼠非酒精性脂肪肝炎症反应 　　目的: 　　机体炎症反应对NAFLD的发生和发展起重要作用。因此，基于第一部分研究，进一步研究副干酪乳杆菌N1115、低聚果糖及其联合应用是否能够减轻高脂饮食诱导小鼠非酒精性脂肪肝的炎症反应。 　　方法: 　　1.检测小鼠血清内毒素(LPS)、二胺氧化酶(DAO)以及血清和肝脏TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ水平。 　　2.RT-PCR检测小鼠肝脏TLR4、NF-kb、InsR、IRS-1mRNA表达水平。 　　结果: 　　1.高脂饮食组小鼠血清内毒素、二胺氧化酶以及血清和肝脏TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ水平，较其余各组均显著升高(P＜0.05）。使用副干酪乳杆菌N1115、低聚果糖以及联合应用干预后，均显著降低了小鼠血清LPS、DAO，以及血清和肝脏中TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ水平(P＜0.05)。 　　2.与高脂饮食组相比，通过副干酪乳杆菌N1115、低聚果糖以及二者联合应用的干预，显著下调了肝脏TLR4、NF-kb mRNA的表达(P＜0.05），并上调肝脏InsR、IRS-1mRNA的表达(P＜0.05）。 　　结论: 　　副干酪乳杆菌N1115、低聚果糖以及联合应用，均可以减少血液循环中LPS的水平，抑制肝脏LPS/TLR4信号通路的激活，减少肝脏炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ等的释放，进而减少高脂饮食诱导的NAFLD的肝脏炎症反应。同时LPS水平的降低以及炎症因子的减少使肝脏InsR、IRS-1mRNA的表达增加，进而减轻机体胰岛素抵抗，起到改善NAFLD的作用。 　　第三部分副干酪乳杆菌N1115联合低聚果糖改善小鼠非酒精性脂肪肝肠粘膜屏障功能 　　目的: 　　肠黏膜屏障功能对NAFLD的发生发展具有重要作用。基于前两部分的研究，进一步研究副干酪乳杆菌N1115、低聚果糖及其联合应用对肠黏膜屏障完整性的影响，从而探讨其改善NAFLD的机制。 　　方法: 　　1.HE染色观察各组小鼠肠粘膜情况。 　　2.RT-PCR分析小鼠肠粘膜紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin的表达。 　　3.通过Western Blotting检测小鼠肠粘膜紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin及p38、p-p38蛋白的表达。 　　结果: 　　1.小鼠肠道病理切片发现HFD组小鼠肠粘膜出现缺损、断裂、腺体破坏、排列不规则、结构紊乱;而通过副干酪乳杆菌N1115、低聚果糖以及二者联合应用干预后，各干预组肠粘膜缺失断裂减少，排列较规则、整齐同时形态有所恢复。 　　2.与高脂饮食组相比，通过副干酪乳杆菌N1115、低聚果糖以及联合应用的干预，显著上调了小鼠肠粘膜Claudin-1、Occludin mRNA和蛋白的表达(P＜0.05)，增加了肠粘膜的完整性。 　　3.使用副干酪乳杆菌N1115，低聚果糖以及二者联合使用能够抑制p38蛋白的磷酸化。 　　结论: 　　副干酪乳杆菌N1115、低聚果糖以及联合应用，均可以通过抑制肠粘膜p38的磷酸化，增加肠粘膜紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin mRNA和蛋白的表达，提高肠黏膜屏障完整性。结合第二部分实验，可以发现改善小鼠肠粘膜屏障完整性能够减少肠道LPS进入机体，抑制肝脏LPS/TLR4信号通路的激活，减少肝脏炎症因子的释放，减轻机体胰岛素抵抗，起到改善NAFLD的作用。