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摘要幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）可能导致胃溃疡、胃炎和胃癌的发生，世界卫生组织已将其列为Ⅰ类致癌原。Hp疫苗的研制有望成为控制Hp感染流行最经济有效的途径。<br>　　Hp嗜中性粒细胞激活蛋白A亚基（neutrophil activating protein A，NapA）是Hp主要毒力因子之一，对Hp的粘附、定植及人体的炎症反应具有重要作用。而且，研究显示，用NapA与黏膜免疫佐剂联合免疫小鼠，可显著减少Hp在宿主胃黏膜的定植，提示NapA是一种保护性抗原。另据报道，NapA具有免疫调节作用，对某些过敏性疾病和肿瘤的生物治疗具有潜在应用价值。而建立有效的NapA制备和传递方法是该蛋白应用研究的重要基础。<br>　　乳酸乳球菌（Lactococcus lactis，L.lactis）是一种食品级益生菌，作为口服疫苗抗原的表达和传递载体，其安全性可靠。因此，本研究应用L.lactis表达系统，建立Hp NapA的表达和传递方法，并鉴定其对动物的免疫效果。<br>　　目的：<br>　　应用L.lactis建立表达Hp NapA的重组菌株，并通过经口免疫小鼠实验，鉴定其对Hp感染的免疫保护效果和对胃肠黏膜免疫的调节作用，为Hp NapA作为口服疫苗和免疫调节剂的应用奠定重要基础。<br>　　方法：<br>　　1.PCR扩增Hp napA基因，将基因片段与pMD19-T载体连接，转入Escherichiacoli DH5α菌株。提取重组质粒pMD19-T-napA和表达载体pNZ8110，经双酶切、连接和电转化将napA基因转入L.lactis NZ3900菌株。<br>　　2.用乳链菌素诱导L.lactis重组菌株表达NapA蛋白。制备菌体蛋白样品，应用Western-blot法鉴定NapA的表达产物及其免疫反应性。<br>　　3.将98只BALB/c小鼠随机分成5组(NapA组、NapA+LTB组、8110组、PBS组和基线组)。前4组分别用L.lactis NZ3900/pNZ8110-napA菌液、NZ3900/pNZ8110-napA与NZ3900/pNZ8149-SP-ltB（课题组前期构建的表达E.coliheat-labile enterotoxin B的L.lactis菌株）混合菌液、NZ3900/pNZ8110菌液和PBS对小鼠进行灌胃，每周1次，共灌胃6次。在末次免疫后2w，每组处死半数小鼠，收集小鼠血清和粪便样品;分离并培养小鼠脾脏细胞，用Hp菌体抗原刺激脾脏细胞，收集细胞培养基上清;用ELISA法检测特异性血清IgG、肠道SIgA抗体及脾细胞培养基中的细胞因子。对前4组剩余小鼠用Hp攻击感染，并检测小鼠胃组织尿素酶活性和Hp定植水平。基线组用于确定胃组织检测指标的基线值。<br>　　结果：<br>　　1.经PCR、酶切鉴定及测序证实，重组菌株L.lactis NZ3900/pNZ8110-napA构建正确。<br>　　2.SDS-PAGE结果显示，L.lactis重组菌株经诱导，表达分子量约为15KD的NapA蛋白，表达量约占菌体蛋白的14％。Western-blot分析显示该蛋白可与小鼠抗Hp免疫血清发生免疫反应。<br>　　3.免疫动物抗体检测:①血清IgG抗体:NapA组高于8110组、NapA+LTB组高于8110组、NapA组高于PBS组、NapA+LTB组高于PBS组，差异均具有统计学意义(P＜0.05);②肠道SIgA抗体:NapA组高于8110组、NapA+LTB组高于8110组、NapA组高于PBS组、NapA+LTB组高于PBS组、NapA+LTB组高于NapA组，差异均具有显著性(P＜0.05)。<br>　　4.细胞因子检测:①IL-2: NapA组高于PBS组（P＜0.05）;②IL-12、IL-23、IFN-γ、IL-8、IL-17: NapA组高于8110组、NapA+LTB组高于8110组、NapA组高于PBS组、NapA+LTB组高于PBS组，差异均具有统计学意义(P＜0.05);③IL-4: NapA+LTB组低于PBS组(P＜0.05)、8110组低于PBS组(P＜0.01);④IL-10: NapA组低于8110组和PBS组、NapA+LTB组低于8110组和PBS组，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。<br>　　5.Hp定植检测:胃组织尿素酶活性和胃组织Hp分离培养:NapA组低于8110组、NapA+LTB组低于8110组、NapA组低于PBS组、NapA+LTB组低于PBS组、NapA+LTB组低于NapA组、基线组低于其它组，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。<br>　　结论：<br>　　1.成功构建Hp napA基因的乳酸菌表达系统L.lactis NZ3900/pNZ8110-napA，且重组表达的NapA蛋白具有抗原活性。<br>　　2.重组菌株L.lactis NZ3900/pNZ8110-napA单独应用或与L.lactis NZ3900/pNZ8149-SP-ltB联合用于经口免疫小鼠，均可引起小鼠特异性血清IgG和肠道SIgA特异性抗体升高，显著减少胃部Hp定植;与NZ3900/pNZ8149-SP-ltB联合应用可显著增强NZ3900/pNZ8110-napA的黏膜免疫保护效果。<br>　　3.重组菌株L.lactis NZ3900/pNZ8110-napA经口免疫小鼠可显著促进Th1和Th17型免疫反应，具有免疫调节活性。<br>　　4.本研究构建的表达NapA的L.lactis重组菌株在Hp口服疫苗和免疫调节剂研究中具有应用潜力。