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摘要HPV(Human papilloma virus，人乳头瘤病毒)可导致人类多种恶性肿瘤，包括头颈癌、口咽癌、肺癌、呼吸道癌及肛门生殖器癌等。根据HPV的致癌潜力不同可以将目前已发现的100多种HPV划分为高危型、中等危害型及低危型。高危型中的HPV16和HPV18的持续感染是人类多种生殖器癌尤其是子宫颈癌的直接诱因。其中，HPV16又是最常见、更容易传播、危害程度最大的高危HPV型。由于高危HPV所致宫颈癌治疗难度很大并且临床预后不佳，导致女性罹患子宫颈癌后的存活率极低。因此，临床上有效的HPV16早期检测不仅能够及时筛查出潜在的患病个体，还能够为有效的控制HPV的传播提供可靠的依据，更能够使患者得到及时有效的治疗并以此提高其生存几率。<br>　　由于针对HPV病毒蛋白的检测方法的特异性和灵敏度不够，FDA目前批准的HPV检测方法主要针对的靶标是HPV的核酸(DNA及RNA)。这些检测方法有杂交捕获信号放大法如HC2(Qiagen/Digene)，实时定量PCR法如Cobas HPV(Roche)，酶切信号放大法如Cervista(Hologic)，NASBA法如Aptima(Gen-Probe)等。但是，这些检测手段都存在诸多缺陷。一方面，由于HPV存在一过性、反复性感染的特性，针对HPV DNA的检测方法出现假阳性、假阴性的几率较大，容易造成误诊和漏诊;另一方面，由于目前针对HPV DNA或RNA的检测方法都需要对靶序列进行扩增以增强检测信号，因而需要高规格的操作环境及高性能的核酸扩增仪器，这不仅大大提高了其成本投入、延长了检测时间，而且还不能反映真实的病毒载量，故不能用于临床HPV感染所致疾病的准确分期。<br>　　因此，研发能够突破现行检测方法瓶颈的HPV检测手段显得尤为重要。本论文叙述了两种以酶联免疫吸附分析技术为基础的新检测体系的建立过程，开展了以HPV RNA为靶标的新型核酸免疫检测方法的研究，探讨其优势及待改进之处，为开发的针对HPV核酸的免疫检测平台奠定了基础。该技术的设计策略是:以HPV16RNA为检测对象（该靶标可作为判断是否存在活病毒的依据从而反映感染状态），设计、筛选特异性探针组合，该探针组合可与HPV16RNA退火杂交形成能够被抗体特异性识别的DNA-RNA杂合体(DNA-RNA Hybrid)，最终通过酶促反应介导的显色或化学发光显示信号以达到对HPV准确、灵敏检测的目的并可真实反映样本中的活HPV的病毒载量。<br>　　针对上述设计思想，本研究对检测体系中的每个环节进行了具体的设计、筛选及优化。在体系构建环节上，本研究以人工合成的互补DNA-RNA杂合体片段为模型，确定了两种高效的固定核酸抗原的方法——抗体捕获法及多聚L赖氨酸(PLL)固定法并优化了检测条件，包括抗体浓度、退火缓冲液离子强度、探针长度及数量等;在探针应用环节上，本研究根据HPV基因组结构特征，大量设计并筛选出了数条具有自主知识产权的特异性识别HPV16RNA特征序列的DNA探针，并成功应用于该检测体系中;在终端信号输出及读取环节上，通过抗DNA-RNA杂合体的单克隆抗体捕获待检抗原，进一步采用化学发光、显色技术体系显示检测信号，实现了对微量HPV病毒检测的目的。结果显示，该核酸免疫检测技术对人工合成的DNA-RNA杂合体片段的检测灵敏度可达到1011M;对HPV16E6、E7体外转录片段的检测灵敏度分别为9.23pg/mL、4.24pg/mL;对细胞株或临床样本中提取的HPV16RNA的检测灵敏度能达到10万级病毒拷贝数。在与国际公认的高危HPV检测方法——Q-PCR法的比较中，该方法与Q-PCR法的检测结果一致，从而证实了该核酸免疫检测方法的准确性与可靠性。<br>　　本论文相关研究工作的创新点及技术优势主要体现在以下几方面:1.成功构建了针对HPV16RNA的酶联免疫分析技术，该技术属独创性质，具有自主知识产权;2.以该酶联免疫分析技术为基础，该研究探索出了两种高效结合核酸抗原的固相载体表面处理方法——抗体捕获法及PLL固定法;3.运用该酶联免疫分析技术，该研究以HPV16RNA为检测对象，不仅可以准确地得到HPV活病毒的载量信息，而且可以为HPV感染后所致疾病的临床分期提供依据;4.该酶联免疫分析技术通过运用特异性的探针组合，提高了检测特异性与灵敏度，与针对HPV基因组的全长的RNA探针相比，极大降低了检测成本;5.该酶联免疫检测法免除了其它HPV核酸检测过程中的扩增步骤，简化了检测流程，节约了分析时间。<br>　　综上所述，通过本研究工作，不仅成功研发了可用于临床的准确、快速、实时、高效的HPV定性、定量检测新技术，而且构建的技术平台可为下一步工作中研制针对HPV检测的系列产品及研发其它核酸分析技术提供关键技术支撑。