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摘要髓系来源的抑制性细胞(MDSCs)是近年广泛研究的具有免疫抑制功能的细胞群，且其在多种疾病中的作用正日益受到关注。在肿瘤部位、感染区域和自身免疫性疾病中，MDSCs呈现募集活化，参与免疫逃逸、免疫耐受以及炎性反应等病理过程。随着研究的不断深入，MDSCs的作用机制逐渐被阐述，发现这群细胞并不限于免疫抑制的功能，在某些情况下可发挥免疫调节的作用，对于维持免疫平衡极为重要。普遍认为，自身免疫疾病患者的免疫系统功能严重紊乱，最近的研究表明MDSCs参与调控多种自身免疫疾病包括类风湿性关节炎、Ⅰ型糖尿病、系统性硬化症及自身免疫性肠炎等的免疫功能，并参与这些疾病的进程，显示MDSCs具有免疫调节的作用。<br>　　系统性红斑狼疮(SLE)作为一种典型的难治性自身免疫性疾病，表现出多种临床表现，其中患者自身免疫耐受缺失，导致多种免疫细胞异常活化。尽管目前对SLE中不同亚群免疫细胞的研究已取得重大突破，但是关于MDSCs在SLE病程中的作用及其机制却仍不清楚。进一步，已知SLE患者易于罹患非霍奇金淋巴瘤(NHL)，MDSCs在NHL的疾病进程中数目增加和功能增强，但其机制不清楚。有趣的是，近年来报道SLE与NHL淋巴瘤患者具有相似的临床症状，以及活动期SLE与B细胞NHL患者骨髓单个核细胞之间基因网络高度一致，提示对NHL中MDSCs的研究可能有助于深刻理解MDSCs在SLE发生及发展中的作用。<br>　　因此，本研究分析了SLE和NHL中MDSCs的数目和功能变化及其对病程的影响，在比较MDSCs对SLE与NHL病程影响的差异基础上，深入理解MDSCs在SLE发生及发展中的作用机制，以便为SLE的诊治提供的理论基础。<br>　　1、发现CCR1是趋化MRL/lpr狼疮小鼠脾脏中G-MDSCs数目增加的关键分子:<br>　　目前MDSCs主要分为两群，即粒细胞样MDSCs(G-MDSCs)和单核样MDSCs(M-MDSCs)。一些利用(NZB×NZW)F1狼疮小鼠进行MDSCs的研究出现相反的结果，且对两群MDSCs细胞的数目和功能变化未进行详细分析。MRL/lpr狼疮小鼠是常用的SLE动物模型之一，且MRL/lpr小鼠的症状与人类SLE十分相似。因此，本研究以MRL/lpr狼疮小鼠为研究对象，探究了G-MDSCs和M-MDSCs的数目和功能变化及其机制。<br>　　发现发病期MRL/lpr狼疮小鼠脾脏中G-MDSCs数目增加，而M-MDSCs数目没有变化;骨髓中这两群细胞都没有发生变化;这些结果提示脾脏中G-MDSCs数目增加可能归因于趋化。进一步发现发病MRL/lpr小鼠中G-MDSCs中相应趋化因子受体1(CCR1)表达升高，并且发病期MRL/lpr小鼠中相应趋化因子单核细胞趋化因子1(MCP1)、趋化因子配体3(CCL3)、趋化因子配体4(CCL4)和趋化因子配体5(CCL5)表达也升高。利用细胞过继转移方法，确认CCR1是趋化G-MDSCs在发病期MRL/lpr狼疮小鼠脾脏中数目增加的关键分子。<br>　　2、发现MRL/lpr狼疮小鼠中IFN-γ影响G-MDSCs的功能变化，而炎症小体活化影响M-MDSCs的IL-1β产生:<br>　　MDSCs发挥功能主要依赖于精氨酸酶(ARG-1)、一氧化氮合酶(iNOS)、活性氧物质(ROS)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-10(IL-10)等功能基因的产生。检测了不同发病时期的MRL/lpr小鼠脾脏中MDSCs功能基因的表达，发现G-MDSCs中的NADPH氧化酶2(gp91phox)表达上调，而M-MDSCs中的IL-1β的表达上调。已报道gp91phox是NADPH氧化酶催化的核心亚基，其表达与ROS水平正相关;炎性因子能促进ROS的释放。发现随着MRL/lpr小鼠发病进程，干扰素-γ（IFN-γ）水平表达上调;外源IFN-γ刺激G-MDSCs不仅能够上调gp91phox的表达，而且提高ROS的产生，显示IFN-γ是导致MRL/lpr狼疮小鼠G-MDSCs产生高水平ROS的重要因素。另外，已报道炎症小体在SLE中是活化的，发现MRL/lpr狼疮小鼠的M-MDSCs中重要炎症小体成分—NOD样受体3(NLPR3)及AIM2的表达明显上调;进一步还发现Toll样受体(TLRs)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(caspase1)和凋亡相关微粒蛋白(ASC)等基因以及caspase1-P20蛋白的表达也上调;说明MRL/lpr狼疮小鼠中M-MDSCs的IL-1β产生与炎症小体的活化密切相关。<br>　　3、发现MDSCs能通过调控Th17/Tregs的分化影响MRL/lpr狼疮小鼠的病程:<br>　　MDSCs的最基本功能是抑制T细胞的增殖和活化。分别进行了G-MDSCs和M-MDSCs与T细胞的共培养实验，结果表明发病MRL/lpr小鼠中的G-MDSCs显著抑制T细胞的增殖与活化，而M-MDSCs的免疫抑制功能不变。已报道G-MDSCs可通过ROS途径抑制TGF-β介导的Tregs的分化。由于发病期MRL/lpr小鼠中G-MDSCs产生高水平的ROS，而Tregs减少，提示G-MDSCs可能通过影响Tregs的分化参与MRL/lpr的发病进程。为此，建立了G-MDSCs与Tregs诱导的共培养体系，结果显示发病期MRL/lpr小鼠中的G-MDSCs抑制Tregs的分化，而N-乙酰半胱氨酸(ROS抑制剂)能够反转其分化。说明发病期MRL/lpr小鼠中G-MDSCs能够通过ROS抑制Tregs细胞的分化。<br>　　为何发病期MRL/lpr狼疮小鼠中的M-MDSCs高表达IL-1β而免疫抑制功能不变呢？已报道M-MDSCs可通过产生IL-1β促进Th17细胞的分化。进行了M-MDSCs诱导Th17的实验，结果表明发病期MRL/lpr狼疮小鼠中M-MDSCs确实能通过产生IL-1β促进Th17的分化，而加入IL-1β的中和抗体后Th17的分化被抑制。表明发病期MRL/lpr小鼠中M-MDSCs能够通过IL-1β促进Th17细胞的分化。<br>　　为了验证MDSCs通过调节Th17及Tregs的分化参与MRL/lpr病程，实施了过继转移和在体删除MDSCs的策略。过继转移MDSCs后，MRL/lpr小鼠脾脏中的Th17升高，而Tregs减低，且症状加剧;而在体删除MDSCs后，MRL/lpr小鼠脾脏中的Th17降低，而Tregs增加，且症状缓解。这些结果说明MDSCs的确能够通过调节Th17及Tregs的分化参与MRL/lpr的疾病进程。<br>　　4、狼疮与NHL均高表达miR-30a，miR-30a可调控MDSCs的分化与功能参与小鼠淋巴瘤的进程，提示MDSCs可能在SLE与NHL的发生及发展中存在共性:<br>　　已知SLE患者易于罹患非霍奇金淋巴瘤(NHL)，其中大部分为B淋巴瘤;B细胞NHL小鼠中MDSCs数目增加，IL-10和ARG-1表达增加，但其机制不清楚。有趣的是，近年来报道SLE与NHL淋巴瘤患者具有相似的临床症状，以及活动期SLE与B细胞NHL患者骨髓单个核细胞之间基因网络高度一致。为了理解MDSCs在SLE发生及发展中的作用，以散播性B淋巴瘤模型小鼠为研究对象探究了G-MDSCs和M-MDSCs水平的数目和功能变化及其机制。<br>　　发现G-MDSCs和M-MDSCs在淋巴瘤小鼠的骨髓和脾脏中数目都显著升高，提示MDSCs在骨髓中分化增加;淋巴瘤小鼠脾脏中G-MDSCs中的ARG-1和ROS相关基因P47phox的表达显著上调，而M-MDSCs中ARG-1和IL-10的表达上调，这与目前报道基本一致。发现淋巴瘤小鼠骨髓和脾脏中的MDSCs均高表达miR-30a。体外实验表明miR-30a明显增加了MDSCs的分化，而转染miR-30a的inhibitor可抑制MDSCs的分化;转染miR-30a的MDSCs中ARG-1、P47phox及IL-10的表达水平显著上调，且抑制T细胞活化和增殖的能力也增强。进一步发现转染miR-30a后G-MDSC中ARG-1和P47phox以及M-MDSCs中ARG-1和IL-10均上调。<br>　　细胞因子信号抑制物3(SOCS3)是酪氨酸蛋白激酶/信号传导子和转录激活子(JAK/STAT)途径的负反馈调节因子之一，负调控JAK2/STAT3信号通路，且研究表明SOCS3影响MDSCs的分化与功能。已知NHL患者中SOCS3低表达，推测SOCS3可能参与NHL中MDSCs的分化与功能。预测miR-30a与SOCS3之间存在靶向关系;发现淋巴瘤小鼠骨髓与脾脏来源的G-MDSCs和M-MDSCs中的SOCS3表达下调;体外转染实验证明miR-30a能够调控SOCS3的表达并活化JAK2/STAT3信号通路，且双萤光素酶报告基因检测系统确认miR-30a与SOCS3存在直接的靶向关系。说明miR-30a通过调控SOCS3参与了MDSCs的功能与分化。<br>　　为了证实是否miR-30a通过调控MDSCs影响淋巴瘤小鼠的发病进程，在体转染miR-30a的antagomir以及agomir到淋巴瘤小鼠中，结果表明转染agomir提高了淋巴瘤小鼠中G-MDSCs和M-MDSCs的数目及其免疫抑制功能，且加重了淋巴瘤小鼠的疾病症状，而转染antagomir的结果相反。体内过继转移入miR-30a-agomir转染的MDSCs后发现，淋巴瘤小鼠发病率和发病周期缩短，而过继转移miR-30a-antagomir转染的MDSCs后，淋巴瘤小鼠发病率降低并且发病时间明显延长。这些结果表明，miR-30a通过调控MDSCs的分化与功能参与小鼠淋巴瘤的进程。已有报道，miR-30a具有促进SLE患者B细胞活化的功能，提示miR-30a对小鼠淋巴瘤MDSCs分化与功能的揭示可能有助于理解SLE的发生及发展。综上所述，本研究发现:①G-MDSCs在MRL/lpr小鼠脾脏中数目增多，G-MDSCs中趋化因子受体CCR1表达升高是导致SLE中G-MDSCs数目增加的原因，M-MDSCs在MRL/lpr的发病进程中数目保持不变;②MRL/lpr小鼠进程中高水平的IFNγ促进G-MDSCs的gp91phox的表达，导致G-MDSCs中ROS的释放增加;G-MDSCs通过产生的ROS抑制Tregs的分化，参与到MRL/lpr的疾病进程;③MRL/lpr小鼠进程中M-MDSCs中AIM2以及NLRP3炎症小体活化，导致M-MDSCs产生大量的IL-1β，M-MDSCs通过产生IL-1β促进Th17细胞的分化，参与到MRL/lpr的疾病进程。④B淋巴瘤小鼠脾脏和骨髓中G-MDSCs和M-MDSCs的数目增多;⑤B淋巴瘤小鼠脾脏中的G-MDSCs中免疫抑制功能基因ARG-1和P47phox表达上调，M-MDSCs中免疫抑制功能基因ARG-1和IL-10的表达上调。⑥MiR-30a能够通过靶向SOCS3活化JAK2/STAT3信号通路参与到MDSCs的功能与分化的调控;⑦MiR-30a能够通过调控MDSCs的分化与功能参与到B淋巴瘤小鼠发病进程。由以上结果显示SLE和NHL中G-MDSCs都表达高水平的ROS，提示MDSCs在SLE与NHL的发生及发展中存在一定的共性。