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摘要蛋白质的翻译后修饰并不仅仅是个简单的修饰过程，它调节着蛋白质的活性、构象、定位、功能以及蛋白质-蛋白质之间的相互作用等。蛋白质翻译后修饰几乎涉及所有生物过程，并和众多疾病发生、发展具有重要的联系。因此，翻译后修饰蛋白质组学是当前基于质谱的蛋白质组学的重要研究部分。翻译后修饰是对蛋白质翻译后进行化学修饰的过程，增加了蛋白质组的复杂性和功能的多样性。翻译后修饰的多样性，使得蛋白质组中蛋白质的数目远远大于基因组的数目。磷酸化和糖基化蛋白质组学研究中的热点问题，磷酸化/糖基化位点的识别和定量对疾病检测鉴定发挥着重要的作用，在开发新的一些疾病靶向药物也起到很重要的作用。这两类翻译后修饰蛋白质的种类虽然很多，但是它们的丰度通常较低，很容易被一些高丰度的蛋白所掩盖，并且修饰基团的存在也会影响其在质谱检测中的离子化效率。另外，在生物样品的处理中常常需要用到非挥发性的盐，稳定溶剂化的样品及维持酶的活性等。许多用于分离生物分子的分离方法也需要高浓度的盐和缓冲溶液，而且，在实际生物样品中往往含有大量的盐类、脂肪以及糖类等生物质。这些污染物的存在的会影响后续质谱高灵敏的分析。因为这些不挥发的低分子量污染物会导致复杂加合物的形成，增加噪音及造成明显的信号抑制。这些污染物的存在严重地干扰了MALDI TOF-TOF MS对磷酸化/糖基化蛋白质及多肽的检测灵敏度。因此要检测这些低丰度的翻译后修饰蛋白，首要任务就是从复杂体系中分离富集出磷酸化或糖基化肽段并除去样品中盐及其他污染物，这也是提高目标磷酸化/糖基化蛋白的质谱检测灵敏度的必要条件。<br>　　目前，已报道的对低丰度翻译后修饰蛋白的富集方法主要为离线富集方法，由于离线富集方法样品需求量很大，并且要经过吸附、分离、洗涤、除盐、解吸等多个步骤，在这些冗长的步骤中很容易造成目标蛋白的损失和引入新的污染物，对MALDI TOF-TOF MS检测造成干扰并导致灵敏度的降低。<br>　　针对这些问题，本论文提出了基于功能高分子图案化靶板的多肽原位选择性富集、纯化和质谱鉴定技术。图案化靶板最外层是由1H，1H，2H，2H-十七氟癸基三甲氧基硅烷(FDTS)修饰的疏水性层;中央是由功能高分子形成的亲和富集点;而位于两者之间的是裸露的硅亲水区域。在富集过程中，样品被外国疏水化材料集中浓缩在中心点，中心点浓缩液中的磷酸化/糖基化肽段通过亲和作用被功能高分子形成的亲和富集点捕捉富集。利用功能化聚合物的图案化靶板，可以实现对多肽的原位、免除盐一步富集和纯化，避免了额外处理步骤中的目标分析蛋白的损失和对样品造成的二次污染，并且功能化高分子图案化靶板大大降低了对待分析样品的需求量。<br>　　基于上述思想和方法，针对磷酸化肽段和糖基化肽段的富集、纯化和质谱鉴定展开研究，本论文完成了如下两个工作:<br>　　1.通过沉淀聚合法合成了钛离子螯合聚甲基丙烯酸-2-甲基-2-丙烯酸-2-羟乙基酯磷酸酯(Poly(MAA-HEMAP)-Ti4+)新型阳离子性聚合物并在硅片上形成图案化表面，以达到对磷酸化肽段的富集、纯化和质谱鉴定。利用傅立叶变换红外光谱、热重分析(TGA)、扫描电子显微镜(SEM)以及能量色散X射线光谱仪(EDX)对制备的阳离子性聚合物复合材料进行了表征，结果表明了复合材料中钛离子的重量含量达到了7％，因此该复合材料在磷酸化肽分离上具有很大的应用潜力。在富集过程中，样品被外圈疏水化材料集中浓缩在中心点，中心点浓缩液中的磷酸化肽段通过钛离子和磷酸盐的螯合作用被Poly(MAA-HEMAP)-Ti4+抓去材料捕捉富集。与此同时，非磷酸化肽和盐分别分布在疏水性和亲水性环形区域。质谱检测结果表明，图案化靶板对酪蛋白酶解液的检测极限是5fmol·μL-1;在酪蛋白和牛血清白蛋白的浓度分别为3fmol·μL-1和1500fmol·μL-1的混合溶液中，图案化靶板也能检测到六个磷酸化肽段;即使样品中含有100mM NH4HCO3，1M NaCl或1M尿素，图案化靶板能分别检测到十、六和六个磷酸化肽段。同时，对生物样品牛奶及血清酶解液和酪蛋白的混合液进行了富集研究结果表明，图案化靶板成功的富集到了其中十一个磷酸化肽段;最后，对胃癌病人血清中的内源性磷酸化肽做了富集研究，成功地富集到了血清中的四个内源性磷酸化肽段。<br>　　2.合成了一种聚1，4-苯乙炔-2，5-苯乙酰胺苯硼酸基醚(PPA-EAPBA)梳形聚合物并在硅片上形成图案化表面，以达到对糖基化多肽的原位免除盐富集。利用傅立叶变换红外光谱、核磁共振分析技术对制备的含硼酸基团新型梳型分子刷化合物表征，结果表明成功的合成了该PPA-EAPBA梳形分子刷。由于PPA-EAPBA梳形分子刷含有大量的硼酸基团，而硼酸基团可以与二醇键合形成高亲和性和可逆的硼酸酯，而糖蛋白及肽段分子中含有多个羟基，故PPA-EAPBA梳形分子刷在糖基化肽分离上具有很大的应用潜力。在富集过程中，样品被外圈疏水化材料集中浓缩在中心点，中心点浓缩液中的糖基化肽段通过硼酸和顺式二羟基的共价结合作用被聚合物分子刷捕捉富集。与此同时，非糖基化肽和盐分别分布在疏水性和亲水性环形区域。检测结果表明，图案化靶板对HRP酶解液的检测极限是118.5fmol·μL-1;在HRP∶BSA=1∶10的混合溶液中，图案化靶板也能检测到四个糖基化肽段;即使样品中含有100mM NH4HCO3或1M NaCl，图案化靶板也能分别检测到十一和十二个糖基化肽段;同时，人免疫球蛋白G(Human Ig G)酶解液和血清（稀释100倍后）按1∶1混合的混合液进行了富集研究结果表明，图案化靶板成功检测到了十个糖基化肽段。<br>　　综上所述，本论文围绕翻译后修饰蛋白质组学研究中磷酸化和糖基化肽段特异性富集和质谱鉴定方面的热点难点问题，以生物质谱技术为基础，以发展相关的蛋白质组学研究新技术新方法并进行实际的应用研究为目标，合成了两种功能高分子材料，并构建了图案化靶板以实现高效高特异性的多肽原位富集、纯化和质谱鉴定的新方法，且该方法能适用于复杂的生物样品如牛奶、血清的肽段富集。这为解决翻译后修饰肽段的研究和高通量质谱检测提供了新颖有效的途径。