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摘要目的：<br>　　肾癌是人类常见的恶性肿瘤，近年来发病率逐年上升。约有20％的患者在初次诊断时就已经发生转移，而近30％的局限性肾癌在手术切除肿瘤后仍会出现复发转移。索拉非尼（Sorafenib）早在2006年就被国家食品药品监督管理总局(CFDA)批准作为肾癌的一线治疗，然而，约有20％的患者在初次用药时即表现出对索拉非尼的先天耐药，而剩余的绝大多数患者在6-15个月左右也会出现继发性耐药，这些因素导致患者在使用索拉非尼治疗后总生存期延长有限。目前肾癌靶向治疗的难点在于耐药机制不明，缺乏有效的生物学标志物来预测索拉非尼的疗效，在出现耐药后没有很好的方法逆转耐药。血管生成素类似物(ANGPTL)在肾癌靶向耐药过程中所起到的作用以及机制尚未见报道。本研究拟探讨血管生成素类似物在肾癌索拉非尼耐药过程中所起到的作用，寻找相关的分子标志物以及逆转耐药的联合治疗靶点，为提高肾癌靶向治疗的效果、进一步延长患者的总生存期提供依据。<br>　　方法：<br>　　1.选取7种常见的肾癌细胞系，测定索拉非尼对其的半数抑制浓度(IC50);同时测定这些细胞中ANGPTL家族8个成员(ANGPTL1-8)的mRNA表达量，结合IC50筛选可能与肾癌索拉非尼耐药相关的成员。<br>　　2.选取20例接受索拉非尼治疗的肾癌患者肿瘤组织标本，其中对索拉非尼耐药和敏感的各10例。测定其中ANGPTL1-8的mRNA表达量，进一步筛选与肾癌索拉非尼耐药相关的成员。结合1的结果，发现ANGPTL3与肾癌索拉非尼耐药关系最大，于是选择ANGPTL3为进一步验证的对象。<br>　　3.进一步扩大样本量验证ANGPTL3mRNA表达量和肾癌索拉非尼耐药的关系。在一个有68例肾癌样本的队例中研究ANGPTL3mRNA表达量和其对索拉非尼反应性之间的关系。<br>　　4.在蛋白层面验证ANGPTL3表达量和肾癌索拉非尼耐药的关系。选择32例肾癌（16例耐药和16例敏感）组织标本进行Western blot检测，比较ANGPTL3表达量和对索拉非尼敏感性之间的关系。收集136例肾癌患者的肾癌资料（70例术后索拉非尼治疗，66例术后无辅助治疗），免疫组化检测ANGPTL3表达量并进行生存分析。<br>　　5.使用两条独立的短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）敲低肾癌细胞株中ANGPTL3的表达量，使用CCK-8增殖实验、Western blot测定凋亡蛋白和流式细胞检测测定细胞凋亡等方法检测肾癌细胞对索拉非尼敏感性的变化。<br>　　6.使用慢病毒转染肾癌细胞株，构建稳定过表达ANGPTL3的肾癌细胞株，使用CCK-8增殖实验、Western blot测定凋亡蛋白和流式细胞检测测定细胞凋亡等方法检测肾癌细胞对索拉非尼敏感性的变化。<br>　　7.将稳定过表达ANGPTL3的OS-RC-2细胞注射于裸鼠皮下构建皮下荷瘤模型。裸鼠予以索拉非尼灌胃(80mg/kg/day)模拟临床给药。每周测量肿瘤大小绘制肿瘤生长曲线，并通过小动物活体成像检测肿瘤大小。<br>　　8.使用人类蛋白组芯片筛选和ANGPTL3结合的蛋白，并通过siRNA缩小筛选范围，最后用蛋白质免疫共沉淀和激光共聚焦验证获得与ANGPTL3相结合的蛋白。并通过构建ANGPTL3的截短体明确ANGPTL3发挥作用的结构域。<br>　　9.利用Rescue方法，证明上述筛选的蛋白在ANGPTL3促进肾癌索拉非尼敏感性过程中发挥作用，并进一步明确其介导调控肾癌索拉非尼敏感性的具体机制。<br>　　结果：<br>　　1.肾癌细胞株中ANGPTL3和ANGPTL7的mRNA表达量与索拉非尼对肾癌的半数抑制量相关。<br>　　2.小样本的肾癌组织筛选发现ANGPTL3的mRNA表达量和肾癌索拉非尼耐药性相关。结合1的结果发现ANGPTL3和肾癌索拉非尼耐药性可能有关，于是选择ANGPTL3作为进一步的研究对象。<br>　　3.扩大样本量验证上述结论:在对索拉非尼耐药的组织和细胞系中ANGPTL3低表达，而在对索拉非尼敏感的组织和细胞系中ANGPTL3高表达。<br>　　4.蛋白水平的验证同样证实ANGPTL3表达量和肾癌索拉非尼敏感性相关。ANGPTL3的表达量和预后相关:ANGPTL3高表达组中，服用索拉非尼的肾癌病人预后要好于未服用索拉非尼的肾癌病人;但是ANGPTL3低表达组中服用索拉非尼无效。<br>　　5.敲低ANGPTL3后肾癌细胞对索拉非尼的敏感性下降:IC50升高，凋亡减少。<br>　　6.过表达ANGPTL3提高肾癌细胞对索拉非尼的敏感性:IC50降低，凋亡增加。<br>　　7.体外实验证实过表达ANGPTL3提高肾癌细胞对索拉非尼的敏感性:过表达ANGPTL3的肾癌移植瘤在索拉非尼作用下肿瘤生长更慢。<br>　　8.ANGPTL3的FBG-like结构域和Focal adhesion kinase(FAK)相互结合。<br>　　9.过表达FAK可以促进肾癌细胞对索拉非尼的耐药，而过表达ANGPTL3可以逆转此效应。敲低ANGPTL3可以提高肾癌细胞对索拉非尼的耐药性，同时敲低FAK可以抵消此效应，而使用FAK的激酶抑制剂PF-562271则并不能逆转ANGPTL3敲低所导致的耐药性提高。进一步研究发现索拉非尼可以抑制FAK的磷酸化，并且促进FAK的入核，进而导致了p53的降解;而过表达ANGPTL3可以抑制FAK的入核，从而抑制p53的泛素化降解，提高p53的表达量。<br>　　结论：<br>　　ANGPTL3在肾癌索拉非尼敏感的组织中高表达，在索拉非尼耐药的组织中低表达，并且索拉非尼在治疗ANGPTL3高表达的肾癌时有着较好的疗效。在索拉非尼作用下FAK进入细胞核促进p53的泛素化降解，导致细胞的耐药;ANGPTL3通过结合FAK，影响了FAK的入核，抑制了p53的泛素化，从而促使p53保持在一个较高的水平，促进了细胞的凋亡等过程，提高了索拉非尼的治疗效果。因此，ANGPTL3可能作为预测肾癌索拉非尼敏感性的生物学标志物，其下游FAK的入核以及p53的泛素化降解也有望成为肾癌靶向治疗的新靶点，有着较好的临床转化前景。