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摘要肝纤维化是由于长期肝损伤形成的一个慢性修复的病理过程，缺氧及缺氧引起的氧化应激参与其中，促进肝纤维化的发生发展。脯氨酸羟化酶1(prolyl hydroxylase1，PHD1)和Kelch样ECH相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein1，Keap1)分别作为细胞内的氧感受器和氧化应激感受器，抑制PHD1和Keap1能够分别通过增强缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor，HIF)和核因子E2相关因子(nuclear factor erythroid2related factor2，Nrf2)的表达，启动下游一系列基因抵抗缺氧和氧化应激。肝细胞作为肝内主体细胞，占肝内细胞的70％，对缺氧极为敏感，在缺氧和氧化应激损伤情况下，释放大量的促炎和促纤维化因子，活化肝星状细胞，推动肝脏炎症和纤维化的发展。<br>　　本研究拟通过构建shRNA干扰质粒载体，分别通过体外体内实验，靶向干预肝细胞内氧感受器和氧化应激感受器，期待能够减轻缺氧和氧化应激损伤，从而减少促纤维化因子释放，达到抑制肝纤维化的作用。如果成功，不仅有助于进一步了解肝纤维化发病机制，而且还能为临床治疗肝纤维化提供新的药物靶点。<br>　　第一章 肝纤维化组织缺氧与氧化应激初步观察<br>　　目的:建立大鼠四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)肝纤维化模型，观察肝组织中缺氧和氧化应激情况<br>　　方法:采用腹腔注射CCl4橄榄油溶液(30％)，每次注射剂量为1.5ml/kg，每周2次，共8周制备肝纤维化模型。肝组织石蜡切片常规HE染色、Masson染色以及免疫组织化学染色检测组织α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)表达来了解肝纤维化程度;采用免疫组织化学染色检测PHD1、HIF-1α、HIF-2α、Keap1和Nrf2的表达，判断肝纤维化组织中缺氧与氧化应激的情况。<br>　　结果:大鼠CCl4肝纤维化模型成功建立。与对照组相比，模型组的肝细胞中HIF-1α、HIF-2α和Keap1表达明显增强，Nrf2表达降低。PHD1变化不大。<br>　　结论:肝纤维化组织内，肝细胞中存在明显缺氧和较强的氧化应激。<br>　　第二章 PHD1和Keap1同时下调对缺氧肝细胞的影响<br>　　目的:检测PHD1和Keap1同时下调对缺氧肝细胞的影响<br>　　方法:构建PHD1 shRNA和Keap1 shRNA质粒载体，荧光显微镜观察肝细胞中转染效率，实时荧光定量PCR (quantitative reverse transcription-polymerase chainreaction，qRT-PCR)检测PHD1、Keap1 mRNA表达并且筛选最佳干扰序列。肝细胞体外培养，分别单转染和共转染PHD1 shRNA和Keap1 shRNA，缺氧处理后①收集肝细胞，检测脂质过氧化物丙二醛(Malonaldehyde，MDA)和还原型谷胱甘肽(Glutathione，GSH)，判断细胞的氧化应激水平。②Annexin Ⅴ-APC/DAPI检测肝细胞凋亡。③乳酸脱氢酶(Lactic Dehydrogenase，LDH)和CCK8 (CellCounting Kit-8)检测肝细胞的损伤。④qRT-PCR，western blot检测肝细胞Ⅰ型胶原蛋白(alpha-1 type Ⅰ collagen，COL1A1)，转化生长因子-β1 (transforming growthfactor-β1，TGF-β1)，血管内皮生长因子-A (vascular endothelial growth factor-AVEGF-A)，胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor, IGF-1) mRNA和蛋白的表达。⑤ELISA检测COL1A1、Ⅲ型胶原蛋白(type Ⅲ collagen，COL3A1)的分泌情况。<br>　　结果:与单转染组相比，共转染组MDA水平降低，GSH升高，肝细胞凋亡减弱。LDH和CCK8结果显示，共转染降低了肝细胞的损伤。并且通过qRT-PCR、western blot检测，共转染组COL1A1、TGF-β1、IGF-1、VEGF-A mRNA和蛋白水平降低，COL1A1、COL3A1的分泌也减少。<br>　　结论:共转染PHD1shRNA和Keap1shRNA能够降低肝细胞的缺氧及氧化应激损伤。<br>　　第三章 PHD1和Keap1同时下调后，缺氧肝细胞对肝星状细胞的影响<br>　　目的:检测PHD1和Keap1共下调的缺氧肝细胞对肝星状细胞的影响<br>　　方法:利用PHD1和Keap1同时下调后缺氧肝细胞培养上清作为条件培养基，培养肝星状细胞，然后通过qRT-PCR、western blot检测肝星状细胞中COL1A1、α-SMA、TGF-β1、IGF-1、VEGF-A mRNA和蛋白的表达。Annexin Ⅴ-APC/PI检测肝星状细胞凋亡，CCK8检测细胞的增值。<br>　　结果:与单转染后的肝细胞上清相比，PHD1 shRNA和Keap1shRNA共转染后的肝细胞上清能明显降低肝星状细胞COL1A1、α-SMA、TGF-β1、VEGF-A、IGF-1mRNAs和蛋白的表达，诱导细胞凋亡，抑制肝星状细胞增值。<br>　　结论:共转染后的肝细胞上清相比单转染的细胞上清能够较好地减轻肝星状细胞激活的作用。<br>　　第四章 肝细胞PHD1和Keap1同时下调对小鼠肝纤维化预防及逆转的影响<br>　　目的:采用尾静脉高压注射PHD1 shRNA和Keap1shRNA真核干扰质粒，观察肝细胞PHD1和Keap1同时下调后对CCl4诱导的小鼠肝纤维化的作用<br>　　方法:采用腹腔注射CCl4建立Balb/c小鼠的肝纤维化模型。从造模第1周至第4周或造模第5周至第8周通过尾静脉高压注射PHD1 shRNA和Keap1 shRNA真核表达质粒。通过荧光显微镜检测PHD1 shRNA和Keap1 shRNA干扰质粒红色和绿色荧光蛋白的表达及western blot检测PHD1和Keap1的表达水平，以此来证实体内基因转染是否成功。石蜡切片进行HE染色、天狼星红染色以及Masson染色来检测不同实验组肝纤维化的程度，采用免疫组织化学染色检测肝组织α-SMA表达来了解肝星状细胞活化情况。<br>　　结果:体内PHD1 shRNA和Keap1 shRNA转染后，在荧光显微镜下观察到小叶下静脉周围肝组织显示较强的红色和绿色荧光，DAPI复染核后发现这些荧光主要存在于肝细胞内。Western blot结果显示共转染PHD1 shRNA和Keap1 shRNA后，PHD1和Keap1蛋白表达低于模型组;HE染色、天狼星红染色以及Masson染色证实PHD1和Keap1下调后，肝纤维化程度轻于模型组;免疫组织化学染色结果发现，与模型组相比，α-SMA阳性表达较弱。<br>　　结论:尾静脉高压注射可成功下调小鼠肝细胞内PHD1和Keap1的表达;体内PHD1和Keap1同时下调后能在一定程度上预防和缓解CCl4诱导的小鼠肝纤维化。